探究培養液中酵母菌種群數量變化的實驗專題研究

在《江蘇省普通高中生物課程標準教學要求(修訂稿)》中，明確指出“探究培養液中酵母菌種群數量變化的實驗”旨在引導學生通過對培養液中酵母菌種群數量的觀察，探究種群數量的變化規律，進而統計數據，建構數學模型，繪制變化曲線。如何使用血球計數板和進行菌體計數是該實驗的重點和難點，建議教師加強實驗演示和指導。在研讀《江蘇省普通高中生物課程標準教學要求(修訂稿)》之后，認為在這個探究活動中彰顯了四個科學方法的完美結合：(1)微生物培養法；(2)抽樣檢測法；(3)顯微觀察法；(4)數學模型法。因此教師需要具有較高的科學素養，才能更好地提高教學的有效性，更好地提高學生科學素養。探究培養液中酵母菌種群數量的動態變化是一項有著多方面意義和價值的探究活動。

1.本探究性實驗的基本程序(表1)

在本探究實驗的基本程序中設計實驗(討論探究思路、制定計劃)和進行實驗(實施計劃)的兩個環節是本實驗的重點，也是難點，教師必需靈活掌握上述四個科學方法是實驗成功的關鍵。下面將逐一介紹這四個科學方法。

2.酵母細胞的培養法

培養酵母細胞是本探究活動的基礎。需要完成以下步驟。

2.1選擇實驗材料和用具

(1)實驗材料酵母菌的優點是一種既能進行出芽生殖又能進行有性生殖的單細胞真核生物。由于酵母菌的生長周期短，增殖速度快，是研究種群數量的增長規律以及種群內部和外部因素對種群個體數量影響的良好實驗材料。

(2)材料用具：酵母菌母液、蒸餾水、無菌水、馬鈴薯培養液、葡萄糖、1 mol/L硫酸溶液、燒杯、試管、滴管、量杯、漏斗、1 mL刻度吸管、標簽、玻璃棒、酒精燈、pH試紙、天平、計數板、恒溫箱、顯微鏡、高壓蒸汽滅菌鍋等。

2.2配制馬鈴薯培養液

(1)培養基成分：

馬鈴薯20 g，葡萄糖2 g，瓊脂1.5-2 g，水100 mL，自然pH。

(2)配制方法：

①配制20％馬鈴薯浸汁：取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加水至1 000 mL。80％浸泡l h，用紗布過濾，然后補足失水至所需體積。100 Pa滅菌20rain。即成20％馬鈴薯浸汁，貯存備用。

②配制時，按每100mL馬鈴薯浸汁加人2 g葡萄糖，加熱煮沸后加入2 g瓊脂，繼續加熱融化并補足失水。

③分裝、加塞、包扎。

④高壓蒸汽滅菌：100 Pa下滅菌20min。

(3)實驗步驟：

①將10 mL馬鈴薯培養液分別加入相同1、2、3號試管，塞上棉塞。

②將酵母菌母液接種入各試管的培養液中，計數起始酵母液個數(No)(注意：從試管中吸取培養液進行記數之前，將試管振蕩幾次)。

③將試管放在25℃條件下培養7 d。

④每天同一時間，從各組取樣計數酵母菌個數，并作記錄，連續觀察7 d。

⑤分析數據，畫出曲線。

3.抽樣檢測法

關于估算種群密度的方法，一般來說，在調查分布范圍較小、個體較大的種群時，可以逐個計數。但是，在多數情況下，逐個計數非常困難，需要采用估算的方法即只計數種群的一小部分，用來估計整個種群。植物可以用樣方法，動物可以用標志重捕法。對一支試管10 mL培養液中的酵母菌逐個計數其起始值和每天的動態數量是很困難的，所以只能估算，用抽樣檢測法，即用吸管吸取一小部分培養液，來計數其酵母菌數，再以此為根據，估算試管中的酵母菌總數。

4.顯微觀察法

在本實驗中，需要測定酵母菌細胞數量。測定酵母菌細胞數目的方法有多種，常用顯微鏡直接計數，此方法必須用到血球計數板，而血球計數板的原理、使用和計算的教學讓教師深感困惑，教師若純粹地理論講解，學生很難理解，教師必需結合新課標的要求、江蘇新高考的形勢和五嚴的背景形勢，利用有限的時間對理論進行精講，并與實踐操作相結合，為此，盡管有許多專家對此做過深入的研究，教師還需結合新課標的要求、新高考的形勢，對血球計數板的原理、使用和計算從更精練但又更系統的方面作研究。

4.1血球計數板的原理

血球計數板是一種專門用于計算較大單細胞微生物的一種儀器，由一塊比普通載玻片厚的特制玻片，制成的玻片中有四條下凹的槽，構成三個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面刻有一個方格網，帶有微小方格的刻度玻璃片，用于顯微鏡下對微生物的計數。

①方格網的構成：

方格網上刻有9個大方格，其中只有中間的一個大方格為計數室，一個血球計數板有兩個計數室。計數室有兩種規格：一種是16中格x25小格；另一種是25中格x16小格，即每一大方格都是由16x25=25x 16=400個小方格組成。

②計數室的規格：

計數室有長×寬：1 mmx1 mm為例，2 mmx2 mm，3 mmx3 mm等，深度均為0.1 mm。

③單位換算：大方格的長和寬各為1 mm，深度為0.1 mm，其體積為0.1 mm(sup)3(/sup)。

大方格的長和寬各為2 mm，深度為0.1 mm，其體積為0.4mm(sup)3(/sup)。

大方格的長和寬各為3 mm，深度為0.1 mm，其體積為0.9 mm(sup)3(/sup)。

4.2血球計數板的計算

(1)計數方法：

①計數室16中格x25小格：大方格的4個頂角，4個中格餌(即4個中格x25小格=100個小格)的酵母菌數。

②計數室為25格x16格，大方格的4個頂角+中央的一個中格(即5個中格x16小格=80個小方格)的酵母菌數(五點取樣法)。

注：人教版建議使用2 mmx2 mmx0.1 mm方格。

(2)10 mL培養液中酵母菌總數的公式(長和寬各為2 mm)：

①16中格x25小格的血球計數板計算公式=[(100小格內酵母細胞個數/100)x400/0.4]x10(sup)4(/sup)稀釋倍數。

②25中格x16小格的血球計數板計算公式=[(80小格內酵母細胞個數，80)x400/0.4]x10(sup)4(/sup)稀釋倍數。

4.3血球計數板的使用方法步驟

(1)菌懸液的制備：以無菌生理鹽水將酵母菌培養液進行適當稀釋成菌懸液。從試管中吸出培養液進行計數之前，要將試管輕輕震蕩幾下，這樣使酵母菌分布均勻，求得的培養液中的酵母菌數量誤差小。

(2)鏡檢計數室：在加樣前，先對計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進行計數。

(3)加樣品：用血球計數板擦鏡紙擦凈，在中央的計數室上加蓋專用的厚玻片，將稀釋后的酵母菌懸液，用吸管吸取一滴置于蓋玻片的邊緣，使菌液自行滲入，多余的菌液用吸水紙吸取，稍待片刻，使酵母菌全部沉降到血球計數室內。加蓋蓋玻片(注意取樣前要搖勻菌液；加樣時計數室不可有氣泡產生)。

(4)找計數室：加樣后靜止5 min，然后將血球計數板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(注意調節顯微鏡光線強弱，使菌體和計數室線條清晰)。

(5)顯微鏡計數：計數時，如果使用16格x25格規格的計數室，要按對角線位，取左上、右上、左下、右下4個中格(即100個小格)的酵母菌數。如果規格為25格x16格的計數板，除了取其4個對角方位外，還需再數中央的一個中格(即80個小方格)的酵母菌數。位于中方格邊線上的菌體一般只計上邊和右邊線上的(或只計左邊和下邊線上的)(圖1)。若芽體達到母細胞大小的一半時，即可作為兩個菌體計數，若芽體小于母細胞一半時為1個酵母細胞。計數一個樣品要從上下兩個計數室中得到的平均數值來計算樣品的含菌量。對每個樣品計數三次，取其平均值。如果一個小方格內酵母菌過多，難以數清，應當對培養液進行稀釋。具體方法是：搖勻試管，取1 mL酵母菌培養液，加入成倍的無菌水稀釋，稀釋n倍后，再用血球計數板計數，所得數值乘以稀釋倍數，以每小方格內含有4-5個酵母細胞為宜。

(6)清洗血球計數板：將血球計數板在水龍頭上用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。用質量分數為95％的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機溶劑脫水使其干燥。鏡檢，觀察計數室內是否有殘留菌體或其它沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至于凈為止。

5.數學模型法

數學模型是用來描述一個系統或它的性質的數學形式。數學模型的一種表現形式是數學方程式，另一種表現形式是曲線圖。本探究實驗兩種數學模型都涉及到了，用數學方程式表示的10 mL培養液中酵母菌總數的公式。用曲線圖表示酵母菌種群數量增長的動態變化(圖2)。在這里要強調一下畫坐標曲線圖必需的注意點：一是畫出橫、縱坐標，并標明名稱與單位，這是學生易忽視的，卻又是高考重要的采分點。二是根據記錄表的數據進行描點畫圖。

6.不可錯過的進一步探究

很多偉大的發現源于實驗過程中的“意外”，實驗者在實驗中也時常靈光閃現。學生在了解基本原理和操作以后，經過實際實驗操作以后，能提出很多新問題。對此進一步探究既是實驗的延續，又是激發學生科學探究熱情的機會。本實驗中酵母菌種群數量增長除了隨時間的變化而變化外，溫度、營養物質、溶氧、pH、代謝廢物(CO(sub)2(/sub))、空間都會影響酵母菌種群數量變化。筆者與學生一起進行常規的溫度、營養物質對酵母菌生長的影響，分別設立三種實驗研究條件。條件一：無菌水10mL，加入干酵母Q1mL，環境溫度28℃。條件二：培養液10 mL，加入干酵母0.1 mL，環境溫度28℃。條件三：培養液10 mL，加入干酵母0.1 mL，環境溫度5℃。實驗結果見表1：

在分析實驗數據時，學生發現條件二這組，培養1 d和培養6 d的酵母菌數均為0.8x10(sup)6(/sup)個/ml，于是學生就產生疑惑：這是為什么呢?我及時解決了他們的疑惑，并乘勝追擊提出如下問題：你認為兩時間段的酵母菌細胞結構和生理特征相同嗎?并說明理由。學生討論激烈，效果顯然。筆者發現學生參與到進一步探究中，既學習知識，又鍛煉了技能，再一次體驗了科學探究的過程。相比于對實驗中既定的變量進行探究，學生有更高的積極性和主動性。進一步探究的實驗結果未知性更強，對于實驗者來說都是一個通過查閱資料，精心設計實驗，相互協作操作解開心中疑團的過程。