TLR4基因多態(tài)性與創(chuàng)傷后膿毒血癥相關性研究

[摘要]目的 探討我國浙江漢族人群Toll樣受體4（TLR4）基因（Asp299Gly和Thr39911e）多態(tài)性與創(chuàng)傷后膿毒血癥的關系。方法 在50例創(chuàng)傷后膿毒血癥患者和100例正常對照者中，采用等位基因特異性聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性方法（ASPCR-RLFP）檢測TLR4 Asp299Gly和Thr39911e基因多態(tài)性，分析TLR4基因多態(tài)性與創(chuàng)傷后膿毒血癥的相關性。結果 在所有的研究對象中均未發(fā)現(xiàn)TLR4 Asp299Gly和Thr39911e基因突變。結論 浙江漢族人群TLR4 Asp299Gly和Thr39911e基因多態(tài)性與創(chuàng)傷后膿毒血癥易感性可能無相關性。

[關鍵詞] TLR4；創(chuàng)傷性膿毒血癥；基因多態(tài)性

[中圖分類號] R631 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）31-25-02

Correlation between the Genetic Polymorphism of Toll-like Receptor 4 and Traumatosepsis

SUN Laifang WANG Zhiyi JIANG Yi GONG Yuqiang KONG Wanquan CHEN Daqing

Department of Emergency， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325027， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between Toll-like receptor-4（TLR4） gene（Asp299Gly and Thr399 Ile） polymorphism and traumatosepsis among Chinese Han nationality from Zhejiang Province. Methods Fifty patients with traumatosepsis and 100 healthy controls were recruited. TLR4 gene Asp299Gly and Thr399Ile polymorphism were analyzed by allele-specific polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（ASPCR-RFLP）.The association between the gene polymorphism and traumatosepsis was analyzed. Results The mutant genotypes of TLR4 gene Asp299Gly and Thr399Ile were not found in all subjects. Conclusion The TLR4 gene Asp299Gly and Thr399Ile polymorphism may not associated with susceptibility to traumatosepsis in Chinese Han population from Zhejiang Province.

[Key words] Toll-like receptor（TLR4）； Traumatosepsis；Genetic polymorphism

膿毒血癥（Sepsis）是指感染和創(chuàng)傷等引起微生物侵入人體誘發(fā)劇烈的全身炎癥反應，并引起組織器官繼發(fā)性損傷的病理生理過程及臨床癥候群，主要由革蘭氏陰性桿菌感染所致。創(chuàng)傷后膿毒血癥的診治一直是臨床急救醫(yī)學的熱點和難點，臨床研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后膿毒血癥的發(fā)生、嚴重程度及預后存在明顯個體差異。本研究從遺傳免疫學的角度出發(fā)，在浙江漢族人群中探討創(chuàng)傷后膿毒血癥的易感性和TLR4基因Asp299Gly和Thr39911e多態(tài)性的關系，為闡明創(chuàng)傷后膿毒血癥的先天性免疫機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究樣本來源于2007年1月～2009年1月收住我院的創(chuàng)傷后膿毒血癥患者及同期來院健康體檢者，所有研究對象均已簽署實驗知情同意書。創(chuàng)傷后膿毒血癥病例組50例，男36例，女14例，年齡26～70歲，平均年齡（51±16.5）歲；正常對照為100例健康體檢者，其中男60例，女40例，平均年齡（52±9.4）歲。以上研究對象均為無血緣關系的浙江漢族人。兩組間性別和年齡分布無顯著性差異（P=0.56）。

1.2#8195;鹽析法提取基因組DNA[1]

所有研究對象各取空腹靜脈血5mL，EDTA抗凝后備用。取血樣0.5mL加細胞裂解液一（內含10mmol/L Tris~HCl pH8.0，10mmol/L KCl，10mmo1/L MgC12，2mmol/L EDTA pH8.0和2.5%Triton x~100）1mL，離心5min（4000r/min），棄上清，再加細胞裂解液一，重復上述步驟兩次。加細胞裂解液二（內含10mmol/L Tris~HCl，pH8.0，10mmol/L KCl，10mmol/L MgCL2，2mmol/L EDTA pH8.0，0.4mmol/L NaCl和10g/L SDS）0.2mL，置56℃ 水浴孵育15min，加入飽和NaCl溶液0.1mL混勻，可見蛋白沉淀析出，離心（5000r/min）10min，取上清液，加入2倍體積無水乙醇，離心（12000r/min）5min，沉淀物加0.1mL TE緩沖液（10mmol/L Tris~HCl pH8.0，1mmol/L EDTA），室溫下溶解2h后進行DNA定量測定。

1.3 TLR4 Asp299Gly和Thr39911e基因多態(tài)性分析

1.3.1 設計引物[2] Asp299Gly位點上游引物：上游引物5’- GATTAGCATACTTAGACTACTACCTCCATG-3’，下游引物5’- GATCAACTTCTGAAAAAGCATTCCCAC-3’，Thr399Ile 上游引物5’- GGTTGCTGTTCTCAAAGTGATTTTGGGA GAA-3’，下游引物5’- ACCTGAAGACTGGAGAGTGAGTTAAATGCT-3’。PCR反應體系總體積25μL，內含引物10pmol，dNTPs 5pmol，TaqDNA聚合酶3U， DNA模板1 μL（約300 ng）。反應條件：94℃預變性3min，接著30個循環(huán)（94℃變性30 s，55℃復性30s，72℃延伸30s），72℃終末循環(huán)5min，最后置于4℃終止反應。

1.3.2 基因型的判讀 Asp299Gly及Thr399 Ile基因PCR擴增產(chǎn)物分別用限制性內切酶Nco Ⅰ、Hinf Ⅰ進行消化酶切，酶切產(chǎn)物采用3%瓊脂糖凝膠電泳，并在VILBER LDURMAT 凝膠成像分析系統(tǒng)觀察拍照。TLR4 Asp299Gly 與Thr399 Ile基因的PCR 產(chǎn)物長度分別是249bp與406bp ，兩者野生型均只有一條帶（分別為249bp與406bp），TLR4 Asp299Gly突變體可與錯配引物形成一個Nco Ⅰ酶切位點，酶消化后則有226bp 和23bp 兩條帶。TLR4 Thr399 Ile突變體可與錯配引物形成一個Hinf Ⅰ酶切位點，酶消化后則有377 bp 和29 bp 兩條帶。

2 結果

對50例創(chuàng)傷后膿毒血癥患者和100例正常人DNA樣本基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)所有DNA 樣本Asp299Gly基因249 bp的 PCR 產(chǎn)物均不能被限制性內切酶Nco Ⅰ酶切為226bp 和23bp兩個片段，即所有研究對象Asp299Gly基因均為野生型A，未見突變型G，結果見圖1。同樣樣本中Thr39911e基因406bp 的PCR產(chǎn)物均不能被Hinf Ⅰ酶切為377bp和29bp兩個片段，即Thr39911e等位基因也均為野生型，未檢測到突變型，結果見圖2。

3 討論

研究證實，Toll樣受體4（Toll-like receptor，TLR4）是識別細菌LPS的受體[3-5]，在宿主防御革蘭氏陰性菌感染及機體天然免疫中的發(fā)揮重要功能。近年來國內外學者非常重視TLR4與各種感染性疾病相關性的研究，有些研究結果顯示，TLR4基因Asp299Gly和Thr39911e多態(tài)性與革蘭氏陰性菌所致的膿毒癥的易感性有關。Agnese等[6]研究表明Asp299Gly、Thr399Ile突變可是使革蘭氏陰性菌感染發(fā)生率明顯升高。Barber RC 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，燒傷患者TLR4的Asp299Gly突變可增加其發(fā)生嚴重膿毒癥的危險性。上述研究表明TLR4基因多態(tài)性與膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，但也有部分研究卻未得到相同結果[8-10]。

本研究通過對中國浙江漢族人群TLR4基因Asp299Gly和Thr39911e多態(tài)性進行檢測，在所有150例樣本中均未發(fā)現(xiàn)其Asp299Gly和Thr39911e基因有突變，提示此等位基因突變在中國浙江漢族人群中少見，TLR4基因Asp299Gly和Thr39911e多態(tài)性與創(chuàng)傷后膿毒血癥無顯著相關性，說明TLR4基因可能不是膿毒血癥的易感基因，這與日本[11]和國內多數(shù)學者[12-13]報道一致。與西方白種人相比，包括我國漢族人群在內的東方黃種人TLR4基因多態(tài)性Asp299Gly和Thr39911e攜帶者的比例較低，而在歐美人種Asp299 Gly突變型較常見，芬蘭人中其頻率高達9.5%[14]。等位基因的多態(tài)性隨人種和地區(qū)的不同而變化，將有助于闡明不同種族和地區(qū)人群在創(chuàng)傷后膿毒血癥發(fā)病機制上的差異。

TLR4在宿主天然免疫應答中發(fā)揮重要作用，TLR4基因Asp299Gly和Thr39911e多態(tài)性在創(chuàng)傷后膿毒血癥的發(fā)病機制中不一定發(fā)揮著首要作用，本研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因兩個功能性位點與創(chuàng)傷后膿毒血癥無明顯相關性，可能因其研究對象樣本量較小，或者與人種的遺傳差別和環(huán)境相互作用有關。

[參考文獻]

[1] 周新文，石云，周宜開. 鹽析法從全血中快速提取高質量的基因組DNA[J].中國醫(yī)學檢驗雜志，2000， 1（2）：94.

[2] Lorenz E， Frees KL， Schwartz DA. Determination of the TLR4 genotype using allele-specific PCR[J]. Biotechniques，2001，31（1）：22-24.

[3] Peltier DC，Simms A，F(xiàn)armer JR，et al. Human neuronal cells possess functional cytoplasmic and TLR-mediated innate immune pathways influenced by phosphatidylinositol-3 kinase signaling[J]. Immunol， 2010，184（12）：7010-7021.

[4] Kirschning CJ，Bauer S. Toll like receptors：cellular signal transducers for exogenous molecular patterns causing immune reponse[J]. Int J Med Microbiol，2001，291（4）：251-260.

[5] Naert G，Laflamme N，Rivest S. Toll-like receptor 2-independent and MyD88-dependent gene expression in the mouse brain[J]. J Innate Immun，2009，1（5）：480-493.

[6] Agnese DM，Calvano JE，Hahm SJ，et al. Human toll-like receptor 4 mutations but not CDl4 polymorphisms am associated with an increased risk of gram-negative infections [J]. J Infect Dis，2002，186（10）：1522-1525.

[7] Barber RC，Chang LY，Arnoldo BD，et al. Innate immunity SNPs are associated with risk for severe sepsis after bum injury[J]. Clin Med Res， 2006，4（4）：250-255.

[8] Skinner NA，MacIsaac CM，Hamilton JA，et al. Regulation of Toll-like receptor （TLR）2 and TLR4 on CD14dimCD16+ monocytes in response to sepsis-related antigens[J]. Clin Exp Immunol，2005，141（2）：270-278.

[9] Gioannini TL，Teghanemt A，Zhang D，et al. Monomeric endotoxin：protein complexes are essential for TLR4-dependent cell activation[J]. J Endotoxin Res，2005，11（2）：117-123.

[10] Lorne E，Dupont H，Abraham E. Toll-like receptors 2 and 4：initiators of non-septic inflammation in critical care medicine? [J]. Intensive Care Med，2010，36（11）：1826-1835.

[11] Imamura Y，F(xiàn)ujigaki Y，Oomori Y，et al. Polymorphism of genes encoding toll-like receptors and inflammatory cytokines in periodontal disease in the Japanese population[J]. J Int Acad Periodontol，2008，10（3）：95-102.

[12] 馮凱，周鋼橋，翟蕓，等. TLR4基因多態(tài)性在中國人群中的初步研究[J]. 中華醫(yī)學遺傳學雜志，2005， 22（1）：99-101.

[13] 郭秋莎，夏冰，李瑾. TLR4 基因Asp299Gly 多態(tài)性與中國漢族炎癥性腸病及大腸癌患者無關[J]. 中華消化雜志，2004，24（5）：306-307.

[14] Lorenz E，Hallman M，Marttila R，et al. Association between the Asp299Gly polymorphisms in the Toll like receptor 4 and premature births in the Finnish population[J]. Pediatr Res，2002，52（3）：373-376.

（收稿日期：2011-08-01）