急性腹瀉患兒諾如病毒檢測和分型

[摘要] 目的 了解蘇州地區(qū)急性腹瀉患兒諾如病毒的分子特征和基因型別。方法 收集蘇州地區(qū)2009年9月～2010年3月共153份5歲以下急性腹瀉患兒糞便或肛拭標(biāo)本，用多重RT-PCR方法檢測諾如病毒，選擇部分陽性擴(kuò)增片段進(jìn)行基因序列測定，并對序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果 急性腹瀉患兒諾如病毒檢出率為16.34%（25/153），均為諾如病毒Ⅱ型，且諾如病毒基因型別均為GⅡ-4/2006b變異株。結(jié)論 諾如病毒是2009～2010年引起蘇州地區(qū)急性腹瀉患兒重要的病原之一，諾如病毒GⅡ-4/2006b變異株或類似株可能是2009～2010年蘇州地區(qū)流行的優(yōu)勢株。

[關(guān)鍵詞] 諾如病毒；分子特征；基因型別

[中圖分類號] R725.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）31-84-02

Detection and Typing of Norovirus of Acute Diarrhea in Suzhou Area， 2009-2010

XUE Hua1 ZHAI Juping2

1.Jinchang District Center for Disease Prevention and Control， Suzhou 215008， China; 2.Department of Clinical Laboratory， the First Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou 215006， China

[Abstract] Objective To investigate the molecular characteristics and genotypes of human Norovirus (NV) in acute diarrhea in Suzhou. Methods Fecal specimens were collected from children (＜5 years) with acute diarrhea. Norovirus of 153 specimens were detected by multiplex RT-PCR. PCR products of several positive samples were randomly selected and sequenced. The sequences were analyzed by phylogenetic analysis. Results Twenty-five Norovirus positive cases were detected in 153 facal specimens (16.34%)， 25 isolates were Norovirus Ⅱ-types. Conclusion Norovirus is one of the major pathogens causing acute diarrhea of children， and GⅡ-4/2006b variant and like strains are probably identified as the prevalent strain from 2009 to 2010 in Suzhou， Jiangsu Province.

[Key words] Norovirus; Molecular characteristics; Genotype

諾如病毒（Norovirus，NV）屬于人類杯狀病毒（human calicivirus，HuCV）科，是引起人類急性病毒性胃腸炎的主要病原體之一，是僅次于輪狀病毒引起的嬰幼兒急性腹瀉的常見病原[1，2]。諾如病毒可通過被污染的水源、食物和人與人之間的接觸等多種途徑進(jìn)行傳播，少量病毒即可引起感染，常在幼兒園、學(xué)校、餐館、軍隊、醫(yī)院、家庭和其他人群中引起暴發(fā)和流行[3，4]。為了解和掌握蘇州地區(qū)諾如病毒的流行情況，我們于2009年9月～2010年3月采集了153份急性腹瀉患兒的糞便標(biāo)本，并進(jìn)行諾如病毒的檢測和分型研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集蘇州地區(qū)2009年9月～2010年3月共153份5歲以下急性腹瀉患兒糞便或肛拭標(biāo)本。

1.2 核酸提取

應(yīng)用PBS溶液將糞便標(biāo)本制備成10%懸液，室溫靜止10min，室溫8000rpm離心5min，離心后取200μL上清，采用德國Qiagen公司QIAamp Viral RNA提取病毒核酸，按照試劑盒操作說明書進(jìn)行，收集終體積為50μL核酸提取液備用。

1.3 RT-PCR檢測諾如病毒

采用多重RT-PCR對樣本進(jìn)行檢測，反應(yīng)引物如表1[5]，采用Takara公司One Step RNA PCR Kit進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：48℃ 30min逆轉(zhuǎn)錄，94℃ 2min，35個循環(huán)（94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min），72℃終延伸7min，4℃終止反應(yīng)，將5μL的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)DNA Marker確定目的條帶的大小。

1.4 核酸序列測定和分析

采用上海朝瑞公司凝膠回收試劑盒回收、純化PCR產(chǎn)物，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。利用MEGA4.0軟件繪制遺傳進(jìn)化樹，所用參考株序列來源于GenBank數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 諾如病毒RT-PCR檢測結(jié)果

多重RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)DNA Marker初步確定顯示目的條帶的片段大小與預(yù)期相符（圖1）。檢測結(jié)果表明，153份糞便標(biāo)本中諾如病毒陽性為25份（16.34%），且均為諾如病毒Ⅱ型。

圖1 諾如病毒RT-PCR產(chǎn)物電泳圖 1：DL2000 Marker；2：陰性對照；

3-8：NV-Ⅱ型

2.2 核苷酸序列比對與進(jìn)化分析

選擇5株諾如病毒Ⅱ型陽性的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行基因測序分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果表明，5株諾如病毒Ⅱ型（5-NVⅡ、16-NVⅡ、23-NVⅡ、70-NVⅡ、139-NVⅡ）與EF670644（2006b/GⅡ-4）、EF670637（2006b/GⅡ-4）、GQ380645（2006b/GⅡ-4）和GQ380645（2006b/GⅡ-4）的同源性高達(dá)97.9%～99.6%，與EF670604（GⅡ-4）和EU400328（GⅡ-4）的同源性高達(dá)93.3%～96.8%，進(jìn)化樹顯示均為GⅡ-4型。

3 討論

1972年，美國學(xué)者Kapikian通過免疫電鏡的方法，從急性腹瀉患者的糞便中首次發(fā)現(xiàn)諾瓦克病毒（Norwalk virus），又稱諾如病毒（Norovirus，NV）[6]。1995年方肇寅等[3]首次在我國嬰幼兒腹瀉糞便中檢測到諾瓦克樣病毒；靖宇等[4]對不同人群的血清抗體水平研究表明我國人群中諾瓦克樣病毒的感染也非常普遍。

越來越多的研究資料表明，諾如病毒在世界各地都有暴發(fā)，特別是在急性病毒性腹瀉中顯示越來越重要的地位。該病毒具有感染劑量低、傳染性強(qiáng)等特點，而且人感染該病毒后僅獲得短期對同型病毒的免疫，而對其他型別的毒株無交叉保護(hù)作用，常會在感染人群中引起暴發(fā)和流行[7-10]。因此，對人類諾如病毒的流行病學(xué)調(diào)查和研究有重要的意義。

為了解蘇州地區(qū)人群諾如病毒流行病學(xué)特點，本研究結(jié)果顯示，本地區(qū)諾如病毒在急性腹瀉患者中占到了17.65%。通過進(jìn)化樹分析表明，本地區(qū)的諾如病毒均為NVⅡ型，且基因型均為GⅡ-4/2006b變異株，該株可能是2009～2010年本地區(qū)的流行優(yōu)勢株。本地區(qū)GⅡ-4/2006b的廣泛流行與我國其他地區(qū)和其他國家的臨床流行病學(xué)研究結(jié)果相一致[9-11]。在過去的幾十年中，諾如病毒引起的全球胃腸炎暴發(fā)和流行都與新的GⅡ-4變異株出現(xiàn)有關(guān)。

總之，諾如病毒在我國是引起急性胃腸炎腹瀉的非常重要的病原，諾如病毒GⅡ-4/2006b變異株可能是本地區(qū)的流行優(yōu)勢株，這些發(fā)現(xiàn)對本地區(qū)病毒性腹瀉的預(yù)防和治療具有重要意義。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Green KY，Ando T，Balayan MS，et al. Taxonomy of the caliciviruses[J]. J Infect Dis，2000，181（Suppl 2）：S322-S330.

[2] Fankhauser RL，Noel JS，Monroe SS，et al. Molecular epidemiology of \"Norwalk-like viruses\" in outbreaks of gastroenteritis in the United States[J]. J Infect Dis，1998，178（6）：1571-1578.

[3] 方肇寅，溫樂英，晉圣謹(jǐn)，等. 在我國腹瀉患兒中發(fā)現(xiàn)諾瓦克樣病毒感染[J]. 病毒學(xué)報，1995，11（3）：215-219.

[4] 靖宇，錢淵，王洛平. 北京地區(qū)人群諾瓦克樣病毒血清抗體水平調(diào)查[J]. 病毒學(xué)報，1998，14（4）：322-328.

[5] Liu LJ，Liu W，Liu YX，et al. Identification of Norovirus as the top enteric viruses detected in adult cases with acute gastroenteritis[J]. Am J Trop Med Hyg，2010，82（4）：717-722.

[6] Kapikian AZ，Wyatt R，Dolin R，et al. Visualization by immune electron microscopy of a 27nm particle associated with acute infectious nonbacterial gastroenteritis[J]. J Virol，1972，10（5）：1075-1081.

[7] Fandhauser RL，Monroe SS，Noel JS，et al. Epidemiologie and molecular trends of“Norwalk-like viruses”associated with outbreaks of gastroenteritis in the United States[J]. J Infect Dis，2002，186（1）：1-7.

[8] Lopman BA，Reacher MH，Duijnhoven YV，et al. Viral gastroenteritis outbreaks in Europe， 1995-2000[J]. Emerg Infect Dis，2003，9（1）：90-96.

[9] 靳淼，孫軍玲，常昭瑞，等. 中國2006~2007年諾如病毒胃腸炎暴發(fā)及其病原學(xué)特征分析[J]. 中華流行病學(xué)雜志，2010，31（5）：549-553.

[10] 龔黎明，葛瓊，盧亦愚，等. 浙江省2006~2007年暴發(fā)性胃腸炎中諾如病毒的分子流行病學(xué)分析[J]. 中華流行病學(xué)雜志，2009，30（2）：147-150.

[11] Mans J，de Villiers JC，du Plessis NM，et al. Emerging norovirus GII.4 2008 variant detected in hospitalised paediatric patients in South Africa[J]. J Clin Virol，2010，49（4）：258-264.

（收稿日期：2011-09-06）