腺相關病毒載體在阿爾茨海默病中的應用

[摘要] 探討腺相關病毒載體在阿爾茨海默病中的應用。腺相關病毒載體是目前基因治療中最常用的病毒載體，由于其具有定點整合、無致病性，通過一系列實驗與研究，證明其可長期表達、免疫反應性小等獨特的生物學特性。取得較為理想的前臨床實驗結果，重組腺相關病毒載體的進展為以后基因治療帶來了希望，為將來進入臨床治療打下了良好的基礎。

[關鍵詞] 腺相關病毒；阿爾茨海默病；開放閱讀框；神經生長因子

[中圖分類號] R749.1+6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）31-15-02

The Application of Adeno-associated Virus Load in Alzheimer’s Disease

GAO Huifang

Dehui People’s Hospital in Jilin Province， Dehui 130300， China

[Abstract] To explore the application of adeno-associated virus load in Alzheimer’s disease. Adeno-associated virus load is the one which is often used in gene therapy， because it owns the unique biological characteristics of integration on special spot， causing no other side effects. According to the results of a series of experiments and study， it can express itself forever and has little bad immune reaction. Its pre-clinic experimental result is ideal. Its advance of reorganization brings hope to future gene therapy and it lays a solid foundation for future clinic treatment.

[Key words] Adeno-associated virus; Alzheimer’s disease; Open reading frame; Nerve growth factor

腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）載體是目前基因治療中最常用的病毒載體。由于其具有定點整合、無致病性、可長期表達、免疫反應性小等獨特的生物學特性，日益受到人們的重視。現針對腺相關病毒的生物學特性和其在阿爾茨海默病中的應用作一綜述。

1 AAV的生物學特性

AAV屬于微小病毒科、依賴病毒屬，直徑約25nm，無包膜，呈二十面體對稱結構。當有輔助病毒如腺病毒等存在時，AAV才能夠進行復制和裝配，因而得名腺相關病毒。目前AAV已經有12種人源性血清型（AAV1～AAV12）和110多種非人靈長類動物源性血清型[1]被發現，其中，AAV2是目前研究最為透徹、應用最為廣泛的血清型。

AAV2基因組[2]是長4.7kb的線性單鏈DNA，包含兩個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）。左側ORF編碼復制調節基因rep，可產生4種Rep蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep68是P5啟動子的轉錄產物，分別通過非拼接和拼接的形式產生，是AAV各生命周期中重要的反式作用因子。在輔助病毒存在時，它們可以促進AAV基因的表達，反之則產生抑制作用，為AAV的復制所必需。由P19啟動子轉錄、分別通過非拼接和拼接形式分別得到Rep52和Rep40蛋白，能夠促進單鏈病毒DNA自聚，以利于其順利為外殼蛋白所包被。右側ORF編碼cap基因，通過P40啟動子轉錄產物的不同拼接形式，產生3種不同的病毒衣殼蛋白—VP1、VP2和VP3。在AAV2中，三種蛋白以1︰1︰10的比例構成病毒衣殼。

ORFs兩側為長145bp的反向末端重復序列（inverted terminal repeats，ITRs）。ITRs是AAV的順式作用元件，其外側的125個核苷酸呈回文序列，可以通過堿基配對自身折疊形成一個“T”型的發卡結構（T-shaped hairpin structure）。ITRs中含有AAV DNA的復制起始位點（origin），其發卡結構中折疊部分可作為自身引物促進其復制過程中第二鏈的合成。在ITRs序列中含有Rep蛋白結合元件（Rep binding elements，RBEs）和末端解離位點（terminal resolution site，TRS），可與復制調節蛋白Rep結合，在從AAV復制起始到形成雙鏈的整個過程中發揮關鍵作用。除復制外，ITRs在AAV基因組的包裝、轉錄、非復制允許條件下的負性調控和點特異性整合等過程中也都是必不可少的。

AAV2可以通過與宿主細胞表面受體硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan）結合進入細胞。此外，還有一些共受體可以增強細胞對AAV2的內攝作用。目前已知AAV2的共受體[3，4]有αVβ5整聯蛋白（αVβ5 integrins）、纖維母細胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1）、肝細胞生長因子受體（hepatocyte growth factor receptor）、αvβ1整聯蛋白（αvβ1 integrin）和層粘連蛋白受體（laminin receptor）等。AAV感染宿主細胞后存在兩種生活周期：溶解期（lytic stage）和溶源期（lysogenic stage）。在輔助病毒（腺病毒或單純皰疹病毒）存在時，AAV進入溶解期，其基因組復制、表達并產生具有感染性的病毒顆粒。而當輔助病毒缺如時，AAV的復制和表達受到抑制，以潛伏感染的形式整合到19號染色體（q13.4）的長4.0kb的AAVS1區域中。定點整合能力是AAV獨有的生物學特性，其機制與AAV基因組中的ITRs、Rep78或Rep68以及一段長138bp的整合效率元件[5]（integration efficiency element，IEE）有關。潛伏感染的野生型AAV在組織培養中不具有致病性。據統計，在人群中70%～80%的個體感染過AAV，但到目前為止臨床上還沒有因AAV感染而引起不良后果的報道。這是AAV的另一個獨特的生物學特性。

2 AAV與阿爾茨海默病

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種發生于老年期或老年前期，以進行性認知障礙和行為損害為主的神經系統退行性疾病，是老年期癡呆的最常見類型。患者尸檢顯示腦組織萎縮，特別是海馬和前腦基底部神經元缺失，組織病理學上的典型改變為β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）沉積形成神經炎性斑（neuritic plaques，NPs）和神經原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）。其發病機制尚未完全明了。

AD在臨床上以腦循環改善劑（如尼莫地平、氟桂利嗪等）、親智能藥（如甲磺雙氫麥角胺、胞磷膽堿等）、神經遞質相關藥物（如多奈哌齊、美金剛、吡拉西坦等）及對癥治療為主，療效有限。AD的基因治療目前多致力于保護膽堿能神經元和減少Aβ的沉積等方面。

2.1 神經生長因子策略

AD認知和記憶功能障礙的主要解剖基礎是海馬組織結構的萎縮，功能基礎主要是膽堿能神經興奮傳遞障礙和中樞神經系統內乙酰膽堿受體變性、神經元數目減少等。目前采用的比較特異性的治療策略是保護中樞膽堿能神經功能。

經大量研究證實，在AD動物模型中，給予神經生長因子（nerve growth factor，NGF）能夠保護膽堿能神經元、改善疾病所致的行為異常。與傳統的膽堿能保護藥膽堿酯酶抑制劑（cholinesterase inhibitors，ChEIs）相比，NGF能夠：①更有效地保護基底前腦膽堿能神經元（basal forebrain cholinergic neurons，BFCNs）；②增加殘余BFCNs活力；③產生更多的乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）而不具有劑量依賴性外周毒性；④能夠保護和修復Ach傳遞的天然時空模式[6]。

對NGF的研究已有數十年的歷史，其在體外及動物體內所取得的實驗結果令人振奮，給AD等神經系統變性疾病的治療帶來了希望。人們試圖將神經營養因子治療策略在動物模型中取得的成功轉化到臨床應用上。目前，NGF已經用于糖尿病性周圍神經病、HIV相關神經病和AD的臨床試驗中。然而，每一項臨床試驗的結果都令人失望，或未見療效，或副作用明顯。NGF在體內半衰期短，不能通過血腦屏障，因此，只有持續將藥物直接作用于靶點才能達到治療目的。因此，若要成功應用NGF治療AD，必須滿足以下兩個條件：①能夠有效作用于靶細胞并能夠在靶作用點長期、穩定表達；②表達范圍不能超過靶細胞以外的區域。Kathie M等提出利用AAV2攜帶人神經生長因子（CERE-110，AAV2-NGF），通過立體定向外科手術的給藥方法作用于Meynert基底核（nucleus basalis of Meynert，NBM）[7]。結果表明，CERE-110可以準確在腦靶作用區域中表達；通過調整給藥劑量，可以控制NGF的表達范圍；NGF的表達在給藥后的3、6、9和12個月時都可以在受試動物中觀察到。目前，應用CERE-110治療輕、中度AD的Ⅰ期臨床試驗業已開展。

2.2 疫苗治療策略

老年斑是AD的特征性病理表現，其主要組成成分為β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）。Aβ沉積與淀粉樣蛋白前體（amyloid precursor protein，APP）的變異及其轉化過程發生改變有關。減少Aβ沉積亦成為目前基因治療的主要靶點之一。

AN-1792，由Aβ42肽和QS-21佐劑構成的世界上第一個Aβ疫苗，于1999年12月進入臨床試驗階段。然而，在2002年1月，由于6%的受試者出現無菌性腦膜腦炎（aseptic meningoencephalitis），以致該試驗在Ⅱa期時被提前中止。尸檢發現，接種者腦中的Aβ明顯減少，并可檢測到浸潤的CD4+ T淋巴細胞。這些結果證實，疫苗啟動了小膠質細胞對Aβ的清除，但也同時激活了Aβ反應性自身免疫T細胞，并使其侵入中樞神經系統，介導了腦部的炎癥反應。令人欣慰的是，獲得抗Aβ抗體的受試者，與未獲得者比較，其認知功能減退的速度明顯降低，日常生活質量顯著提高。因此，Aβ疫苗依然是一種充滿希望的AD治療策略，但必須要解決其所涉及的安全性問題。為此，科研人員開發了各種各樣的技術，力求在增加特異性抗體產生的同時，盡可能地減少自身免疫性T細胞毒性作用。

腺相關病毒因為其本身的低免疫源性和無致病性為Aβ疫苗的應用開拓了新的思路。Zhang等利用腺相關病毒作為載體，嘗試不同的給藥途徑，在AD轉基因小鼠體內表達CB-Aβ42（霍亂毒素B亞基和Aβ42融合蛋白）。結果證明，這種AAV-CB-Aβ42誘導產生了可長期表達的高水平的Aβ特異性抗體，提高了小鼠的記憶和認知能力，減少了腦內Aβ的積聚和相關的星形膠質細胞增生。這些實驗結果證實了AAV介導Aβ疫苗的安全性和有效性，相信會給AD的疫苗治療帶來新的生機。

2.3 其他

重組腺相關病毒載體還廣泛用于其他各種AD基因治療中。如其在細胞內抗體（intracellular antibodies）、腦啡肽酶（neprilysin，NEP）、載脂蛋白E基因（ApoE）等的應用中，都取得了較為理想的前臨床實驗結果，這為其將來進入臨床治療打下了良好的基礎。

3 展望

基因治療已經成為目前醫學研究的熱點。有效的基因治療需要解決以下3個問題：①在分子水平上闡明疾病發生的機制；②找出治療疾病的相關基因；③應用適合的載體通過合理的方法將目的基因導入靶細胞。目前用于基因治療的載體分為兩類：非病毒載體和病毒載體。前者包括裸DNA（purified DNA）、基因槍（shotgun）和脂質體-DNA復合物（lipid-DNA complexes）等。這些非病毒載體各具特色，但其基因傳遞和表達效率較低，不能滿足人們的需要。目前主要的病毒載體包括逆轉錄病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、腺病毒和腺相關病毒等。每一種病毒載體都各具有其優點和缺點。其中，腺相關病毒由于具有宿主范圍廣、能夠定點整合入人類染色體、無致病性、可以穩定和長期表達、免疫源性小等特點，日益受到科學工作者的青睞。目前，rAAV已經成功地轉導了肌肉、肝、腦、視網膜和肺等組織。有關rAAV載體介導的各種臨床試驗也正在開展中。此外，對AAV載體本身的改造亦沒有停止，一系列的努力克服了AAV自身的局限性，極大地拓寬了它的應用范圍。

基因工程的研究已經有數十年的歷史，但是，到目前為止，還沒有哪一種載體在基因治療中是盡善盡美的，盡管重組腺相關病毒載體在多種疾病的病因學和動物實驗中都取得了可喜的進展，但是以腺相關病毒作為載體的臨床試驗，其結果都不能令人滿意。腺相關病毒載體還存在許多問題（例如免疫反應等）限制了它更為廣泛的應用。關于基因治療，我們還有很長的路要走。重組腺相關病毒載體的進展為基因治療的明天帶來了希望，還需要廣大科研工作者不斷地進行更為深入的研究。

[參考文獻]

[1] 蔡炯，牛娜，李方，等. 腺相關病毒介導β淀粉樣肽單鏈抗體對動物阿爾茨海默病的治療效果[J]. 中國醫學科學院學報，2011，33（2）：151-155，221.

[2] Daya S，Berns KI. Gene therapy using adeno-associated virus vectors[J]. Clin Microbiol Rev，2008，21（4）：583-593.

[3] 蔡炯，李方，王世真，等. 阿爾茨海默病患者β淀粉樣肽40人單鏈抗體在大腸桿菌的表達和純化[J]. 中國臨床康復，2006，10（2）：114-116.

[4] 陳彪，馬秋蘭. 阿爾茨海默病病因學研究進展及治療展望[J]. 中華神經科雜志，2003，36（2）：158-160.

[5] Singer O，Marr RA，Rockenstein E，et al. Targeting BACE1 with siRNAs ameliorates Alzheimer disease neuropathology in a transgenic model[J]. Nat Neurosci，2005，8（10）：1343-1349.

[6] Bishop KM，Hofer EK，Mehta A，et al. Therapeutic potential of CERE-110 （AAV2-NGF）: targeted， stable， and sustained NGF delivery and trophic activity on rodent basal forebrain cholinergic neurons[J]. Exp Neurol，2008，211（2）：574-584.

[7] Bard F，Cannon C，Barbour R，et al. Peripherally administered antibodies against amyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease[J]. Nat Med，2000，6（8）：916-919.

（收稿日期：2011-09-15）