BMP-2誘導MSCs修復無血運區(qū)半月板損傷的實驗研究

資料與方法

實驗動物：6～12個月齡新西蘭大白兔36只，雌雄不限，體重2～3kg。

實驗方法：

⑴自體纖維蛋白原的制備：用10ml無菌注射器自兔股動脈抽取動脈血約10ml，注入10ml無菌試管內，每個無菌試管內預先注入1ml的10%枸櫞酸鈉溶液并涂布整個試管壁，所得兔血經3200rpm離心10分鐘后去除沉淀的血細胞，保留上清(即兔血漿)。向兔血漿中按體積比例5:1加入4℃的飽和硫酸銨溶液，立即出現(xiàn)乳白色的絮狀沉淀。經3200rpm離心3分鐘后去除上清，所得的乳白色沉淀即為兔的纖維蛋白原，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

⑵骨髓間充質干細胞的分離及培養(yǎng)：無菌條件下，從自體新西蘭大白兔雙側股骨轉子用骨髓穿刺針穿刺，10ml無菌注射器抽出骨髓約5ml，離心后標本從上至下依次為:稀釋液層、呈乳白色絮狀的有核細胞層、分離液層及管底的紅細胞層，小心吸取富含有核細胞的界面層，骨髓間充質干細胞即包含在該層細胞中；用MDME培養(yǎng)基洗滌1次加入DMEM完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，計數(shù)細胞，測定細胞活力。以5×104/ml的密度接種于75ml培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)第2天首次換液，換液時將培養(yǎng)液中懸浮的細胞離心收集后置入原瓶內繼續(xù)培養(yǎng)，以后隔天換液1次，倒置顯微鏡下逐日觀察細胞形態(tài)及生長情況。

⑶纖維蛋白膠、骨髓間充質干細胞及BMP-2混合物的制作：原代骨髓間充質干細胞培養(yǎng)第10天左右，倒置顯微鏡下呈融合狀，收集原代的MSCs，用DMEM培養(yǎng)液制成1×106/ml的細胞懸液，并將纖維蛋白原解凍后預加溫至37℃，備用。向24孔板的的每孔中滴入100μl骨髓間充質干細胞懸液，加入200μl的纖維蛋白原溶解于細胞懸液中。再先后加入預先加熱至37℃的40mmol/ml氯化鈣溶液60μl及50IU/ml的凝血酶溶液40μl，然后置于37℃恒溫箱中數(shù)分鐘至纖維蛋白膠凝塊形成，最后在置入半月板缺損處時快速用微量注射器將已溶于1μl無菌蒸餾水的5mgBMP-2注入其上，即制成纖維蛋白膠、骨髓間充質干細胞及BMP-2混合物。

⑷動物模型的制作：6～12個月齡新西蘭大白兔36只，雌雄不限，體重2～3kg，隨機分成A、B兩組，每組18只。以質量分數(shù)25mg/ml的戊巴比妥鈉對實驗動物進行耳緣靜脈注射麻醉(1ml/kg)。無菌條件下，取雙膝髕韌帶內側弧形切口，沿髕骨內上緣至脛骨結節(jié)處切開皮膚，在髕韌帶內側切開關節(jié)囊，將髕骨向外側脫位，屈曲膝關節(jié)，以小拉鉤顯露半月板前角、體部及股骨髁軟骨面，用無菌手術刀片于半月板體部無血運區(qū)作一長約0.5cm，寬約0.1cm縱形全層裂傷。A組(36膝)每只對其雙膝隨機采取一側于半月板損傷區(qū)注入纖維蛋白膠(FG組)，另一側為空白對照組(NT組)，對損傷區(qū)不做任何處理；B組(36膝)對其雙膝隨機采取一側于半月板損傷區(qū)注入纖維蛋白膠與骨髓間充質干細胞混合物(FM組)，另一側于膝關節(jié)半月板損傷區(qū)注入纖維蛋白膠+骨髓間充質干細胞+骨形態(tài)發(fā)生蛋白混合物(FMB組)，所有半月板損傷區(qū)均依靠凝膠的黏附性與缺損周圍組織緊密黏連，不予縫合。逐層關閉切口，1-0線縫合，所有術肢不行固定。術后每只兔子給予8萬U慶大霉素，連續(xù)7天。

⑸組織取材及檢測方法：分別于術后4周、8周、12周以靜脈氣栓法將實驗動物處死，分別取下半月板，修去多余的組織，半月板損傷區(qū)修復情況行大體觀察、光鏡組織學檢查及電鏡檢查。①大體觀察：觀察傷口有無感染，關節(jié)有無充血、水腫及黏連；半月板損傷區(qū)的修復情況，纖維蛋白膠有無脫落，損傷區(qū)有無新生組織及其平整性、光澤度及其與周圍組織的結合情況，將觀察到的全部半月板愈合情況，按評定指標對其進行效果評定，并進行統(tǒng)計學分析。②光鏡組織學檢查：觀察新生組織的結構組成，半月板損傷區(qū)纖維軟骨的數(shù)量變化，基質分泌及膠原纖維的結構，以及FG支架的吸收情況，12周時行GAG組織化學染色，光學顯微鏡下觀察修復組織中GAG染色的情況，以周圍正常纖維軟骨組織飽和著色定為100%，組織不著色定為0%，色度高低對應GAG含量，計算機HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖象分析系統(tǒng)進行分析，統(tǒng)計學處理。組織取材后，修剪組織塊，制成切片，HE染色及甲苯胺藍染色。

結 果

所有實驗動物術后無感染，無死亡，術后1周內略有跛行，1周后恢復正常。

大體觀察：所有動物關節(jié)無紅腫，關節(jié)腔內有少許談黃色關節(jié)液，清亮透明。關節(jié)囊無攣縮，無黏連，滑膜無充血，無水腫。①空白對照組(NT組)：術后4周，半月板縱行全層裂清晰可見，缺損處無填充物，表面凹凸不平，邊緣清晰。術后8周，半月板缺損區(qū)有薄層膜性組織覆蓋，邊緣清楚，色澤灰暗。術后12周，半月板缺損區(qū)較前略有縮小，邊緣不整齊，色澤較暗，缺損仍清晰可見。②單純纖維蛋白膠組(FG組)：術后4周，半月板缺損區(qū)支架材料與周圍組織未融合，支架部分塌陷，植入物表面無光澤，按壓僅部分阻抗，缺損清晰可見。術后8周，半月板缺損區(qū)填充物無融合，部分缺損無填充，支架塌陷，按壓無阻抗。術后12周，半月板缺損區(qū)范圍縮小，底部有1/3纖維成分填充。③FG+MSCs組(FM組)：術后4周，半月板缺損區(qū)支架材料與周圍組織部分融合，無明顯塌陷，但表面缺乏光澤，按壓部分阻抗。術后8周，半月板缺損區(qū)修復組織與周圍組織融合尚可，按壓部分阻抗，修復組織高度約為缺損的1/2。術后12周，半月板缺損區(qū)修復組織與周圍軟骨組織大部分融合，較前略有光澤，有一定阻抗，修復組織高度約為缺損的3/4。④FG+MSCs+BMP-2組(FMB組)：術后4周，半月板缺損區(qū)支架材料無脫落，與周圍組織融合好，按壓有阻抗，表面有光澤。術后8周，半月板缺損區(qū)修復組織與周圍組織融合好，表面光滑，按壓有阻抗，修復組織高度與周圍組織相平。術后12周，修復組織與周圍纖維軟骨組織無明顯界限，表面光滑，有光澤，按壓阻抗與周圍組織相似。

光鏡組織學檢查：①空白對照組(NT組)：在術后各觀察期半月板始終未愈合，裂口邊緣的軟骨細胞處于低代謝狀態(tài)，細胞體積小，軟骨囊消失。②單純纖維蛋白膠組(FG組)：術后4周半月板移植區(qū)仍見少量凝膠存在，少量纖維組織長入其中，可見少量成纖維細胞生長，創(chuàng)面邊緣組織內的軟骨細胞代謝緩慢，略有萎縮。8周時缺損處凝膠已很少，內見少量成纖維細胞，分布于裂口邊緣，未見軟骨細胞，有膠原纖維沉積。12周時，移植區(qū)己無凝膠，見少量成纖維細胞，膠原纖維排列紊亂。③FG+MSCs組(FM組)：術后4周，半月板移植區(qū)仍可見大量凝膠存在，有部分纖維組織長入，呈成纖維狀，數(shù)量較FG組增多。8周時，凝膠基本消失，其內偶見軟骨細胞。12周時，可見許多成纖維細胞，膠原纖維排列欠規(guī)則。④FG+MSCs+BMP-2組(FMB組)：術后4周移植區(qū)仍見凝膠存在，被纖維組織所充填，細胞形態(tài)呈成纖維狀，數(shù)量多。術后8周，凝膠基本消失，術后12周有較多的膠原纖維形成，可見成團的軟骨細胞，有軟骨囊形成，并有較多的同源細胞群，愈合組織與正常組織之間以膠原纖維相連，沒有間隙，膠原纖維排列規(guī)則。GAG組織化學染色結果：術后12周，缺損區(qū)修復組織及修復細胞周圍可見甲苯胺藍染以陽性物質，與周圍正常纖維軟骨組織GAG染色一致，表示為黏多糖物質，F(xiàn)G組及FM組基質染色較FMB組明顯變淺且不均勻，經計算機病理彩色圖象分析及統(tǒng)計學處理有統(tǒng)計學意義。

電鏡檢查：12周時，NT損傷邊緣組織可見到調亡軟骨細胞，膠原纖維粗細不等，排列不規(guī)則。FG組纖維軟骨細胞有突起，細胞形狀不規(guī)則，膠原纖維粗細不等，排列不規(guī)則。FM組纖維軟骨細胞有突起，核糖體豐富，膠原纖維豐富排列規(guī)則。FMB組軟骨細胞有突起，高爾基復合體及粗面內質網豐富，膠原纖維豐富，排列規(guī)則。FM組膠原與軟骨細胞的形態(tài)明顯好于FG組而不及FMB組。

統(tǒng)計學結果：在α=0.05的檢驗水準上，經Kruskal-Wallis檢驗，P＜0.05可以認為半月板愈合情況有差異。經兩兩比較不可以認為NT組與FG組、NT組與FM組、FG組與FM組之間的愈合情況有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，可以認為NT組與FMB、FG組與FMB組及12周時FM組與FMB組之間的愈合情況差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。GAG組織化學染色結果經q檢驗差異有顯著意義(P＜0.01)。

討 論

半月板損傷的臨床治療：由外傷、退行性病變、炎性疾患等原因所致的半月板損傷是常見疾病。其治療方式可概括為以下幾種：①損傷半月板留置加關節(jié)腔內藥物注射治療。對不需手術的患者，藥物能促進損傷半月板的愈合，縮短修復時間；對已行半月板手術的患者，藥物也能減輕手術所致的炎癥反應，膝關節(jié)是否需要限制活動一段時間還沒有統(tǒng)一的認識。②開放性半月板全切和部分切除術治療。半月板切除術后也會引起膝關節(jié)運動的變化：切除內側半月板會增加膝關節(jié)的內翻程度；切除外側半月板，外翻增加了；載荷、運動功能的變化已被證明能干擾關節(jié)軟骨、軟骨下骨所處的生化環(huán)境，而這些變化如蛋白聚糖含量的減少；膠原、蛋白聚糖合成速度的變化；蛋白聚糖結構的改變；滑液成分的改變，與OA的形成有關。③半月板修復治療：一般認為位于有血運區(qū)即紅-紅區(qū)、紅-白區(qū)的撕裂才適合修補，采用半月板修補術有一定的指征。④關節(jié)鏡下半月板部分切除術。關節(jié)鏡手術具有手術創(chuàng)傷小，危險性小、術后無須制動能早期活動、病程短的優(yōu)點。⑤同種異體半月板移植重建半月板。用半月板移植來取代缺損的半月板已在人、山羊、狗、的實驗中取得成功。⑥組織工程用于半月板損傷的治療。隨著對細胞生化學、生長因子治療、基因治療、材料工程的研究，組織工程用于半月板損傷修復和替代治療，結果令人鼓舞。

綜上所述，半月板損傷經歷了由不治療到治療、由完全切除到盡量保留、由開放手術到關節(jié)鏡下手術、到移植、重建等治療階段；如何保全和建立半月板結構、形態(tài)的完整，保證其正常的生物力學功能，是治療的關鍵和目的。

結論：①自體纖維蛋白膠具有取材方便、無免疫原性等優(yōu)點，可作為一種理想的載體。②BMP-2可誘導骨髓間充質干細胞向纖維軟骨細胞方向分化。③以自體纖維蛋白膠為基質材料，BMP-2可誘導MSCs轉化成纖維軟骨細胞用于修復半月板損傷。

參考文獻

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