基因組改組構建柔紅霉素高產菌株

摘 要:目的:構建高產菌株，提高柔紅霉素發酵效價。方法:使用基因組改組法，用搖瓶測試發酵效價。結果:使柔紅霉素效價提高105%。結論:使用基因組改組的方法可以大幅度的提高柔紅霉素發酵效價。

關鍵詞:柔紅霉素菌株基因組重排

中圖分類號:R2文獻標識碼:A文章編號:1674-098X(2011)08(b)-0051-02

臨床上鹽酸柔紅霉素是治療急性非淋巴細胞性白血病的一線藥物，對兒童白血病也有良好的緩解作用，30年沒有被其他藥物取代。在制藥領域是去甲氧柔紅霉素、阿霉素和表阿霉素的合成起始原料。隨著人類的癌癥發病率逐年提高，鹽酸柔紅霉素的市場容量也在快速上升，2009年被收錄到《國家基本醫療保險藥品目錄》。然而較低的發酵效價造成了昂貴的生產成本，致使售價居高不下。降低生產成本，減少患者的負擔是我們當前迫切需要解決的問題。

2002年建立的基因組改組(genome shuffling)技術，應用多親本遞近融合(recursive fusion)，定向篩選具有重要表型特征改變的突變體，已經成功地用于工業微生物多基因控制表型的改良[1～4]。高雯采用紫外誘變和基因組改組相結合的方法構建柔紅霉素高產菌株，使發酵單位提高60%[5]。劉連碧等使用鏈霉素抗性篩選法，提高柔紅霉素發酵單位50%[6]。本次研究將采用鹽酸胍和紫外聯合誘變與基因組改組相結合的方法，并使用鏈霉素抗性篩選法進行柔紅霉素高產菌株的構建。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

親本:S-07A:發酵效價為1000mg/L。保存于魯南制藥科研部。

1.1.2 融合培養基及試劑[7]

亞硝基胍(NTG)，甲醇(AR)，0.9%生理鹽水，YEME液體培養基，10.3%蔗糖溶液，TSA平板，P緩沖液，10mg/ml溶菌酶溶液(用P緩沖液溶解)，25% PEG4000(用P緩沖液溶解)，R2軟瓊脂，R2YE平板。

TM緩沖液(Tris-馬來酸緩沖液):Tris0.121g，馬來酸0.116g，純化水20ml調節pH6.0，121℃滅菌5min。

種子搖瓶培養基:玉米淀粉4.0％，葡萄糖1.0％，麩皮1.0％，麩質粉0.5％，KH2PO4 0.1％，(NH4)2SO4 0.1％，CaCO3 0.4％，pH自然。裝60ml于500ml搖瓶中，121℃滅菌30min。

發酵搖瓶培養基:玉米淀粉7.0%，麩皮1.0%，麩質粉0.5%，KH2PO4 0.1%，(NH4)2SO41.0%，CaCO30.8%;pH自然。裝30ml于250ml搖瓶中，121℃滅菌30min。

1.1.3色譜條件

高壓液相色譜Agilent C18色譜柱(53mm*7mm，3μm);流動相:15mmol/L的磷酸二氫鉀－乙腈(1∶1);柱溫25℃;流速1.0ml/min;檢測波長:254nm。

1.2 方法

1.2.1 菌種誘變

取菌種S-07A甘油管2支融化后分別用紫外和NTG進行誘變。紫外誘變:15W，254nm，距離30cm紫外燈下，緩慢轉動誘變1min。將菌液離心，棄上清，用生理鹽水懸浮為2ml菌液。NTG誘變:將菌液離心，棄上清，加入1ml TM緩沖液，分散均勻，稱取1mg NTG并用1滴甲醇溶解后加入菌絲懸浮液中，于30℃搖床中220rpm誘變120min。將菌液離心，棄上清，用生理鹽水洗滌3次后懸浮為2ml菌液。

1.2.2 菌絲體制備

將2種經過誘變的菌種都進行以下操作:接種菌液2ml于裝量60ml含6μg/ml鏈霉素YEME的500ml三角瓶中，于29℃搖床中220rpm培養42h。吸取菌液3ml接種于裝量30ml含有0.5%甘氨酸的YEME250ml三角瓶中，于29℃搖床中220rpm培養42h。鏡檢確定無菌。

將菌液倒入50ml無菌離心管，5000rpm，10min，棄上清。用10ml 10.3%蔗糖溶液洗滌菌絲體一次，棄上清。再加10ml 10.3%蔗糖溶液用漩渦振蕩將菌絲分散均勻，分裝于1.5ml離心管中，每管裝1ml。取1管涂布TSA平板作無菌檢查。其他管離心，棄上清，于-20℃保存。

1.2.3 原生質體制備

取3個小離心管，用1ml P緩沖液分散菌絲、洗滌、離心、棄上清。加800μl P緩沖液漩渦振蕩使菌絲分散均勻，再加入200μl 10mg/ml溶菌酶溶液，充分混勻，于30℃水浴酶解90min。500rpm離心5min，將上部原生質體懸浮液轉移到另一只無菌1.5ml離心管中，3000rpm離心10min沉淀原生質體，棄上清。用1ml P緩沖液洗滌一次，棄上清。加500μl P緩沖液，用血球計數板計數，并配成107個/ml的原生質體溶液。

1.2.4 原生質體滅活

將紫外誘變和NTG誘變菌株原生質體等量混合后分為2份，取1份置于60℃水浴中處理120min滅活，另一份置于冰水浴中處理120min。

1.2.5 原生質體融合

將2種不同處理的菌液混合，3000rpm離心10min，棄上清。然后加入1ml P緩沖液，充分懸浮，3000rpm離心10min，棄上清。重復以上步驟一次。徹底甩干留在管底的液滴。

輕敲管壁，打散沉淀。加入0.5ml 25% PEG4000(30℃水浴保溫)，充分懸浮。室溫放置1min。加0.5ml P緩沖液稀釋，3000rpm離心10min，棄上清。用P緩沖液洗滌一次，3000rpm離心10min，棄上清。加入100μl P緩沖液，懸浮原生質體，與4mlR2軟瓊脂(50℃水浴保溫)混合，迅速傾注在R2YE平板上，28℃恒溫培養至菌絲體較稠密。

將上述R2YE平板軟瓊脂再生菌層用接種鏟刮下來，梯度稀釋，接種到含12μg/ml鏈霉素的R2YE平板上，28℃恒溫培養至長出成熟菌落。挑取紅色園斑大者為第一輪融合結果G1。

1.2.6 雜合子代原生質體的制備、融合及篩選。

將上一次融合并篩選后的多個菌株(G1)繼續進行下一輪的原生質體制備、滅活、融合與再生，所得菌落梯度稀釋后經18μg/ml鏈霉素的R2YE平板篩選，所得菌株即G2。以未經PEG處理的每一輪原生質體再生菌株作為對照。

2 結果與分析

2.1 初始菌株篩選

本研究采用紫外和NTG誘變，對S-07A進行處理，通過鏈霉素抗性平板進行篩選，得到3株紫外誘變菌株(Dau UV1-3)和4株NTG誘變菌株(Dau NTG1-4)，以此作為初始菌株進行基因組改組。

2.2 基因組改組

將第一輪融合子涂布到含12μg/ml鏈霉素的R2YE平板上，挑選8株紅色斑點大的菌株，即第一輪改組菌株(Dau G11-18)。將所得8個G1菌株按同樣的策略進行培養，制備原生質體，融合，再生后在更高鏈霉素濃度18μg/ml R2YE平板篩選，獲得4個第二輪改組菌株庫(Dau G21-24)。

將S-07A、Dau UV、Dau NTG)與Dau G2分別于0μg/ml、6μg/ml、12μg/ml、18μg/ml鏈霉素平板上培養。結果見表1。

結果表明第二輪改組菌株對鏈霉素的抗性最強，比原始菌株提高了18μg/ml。

2.3 搖瓶發酵效價比較

將S-07A、Dau UV、Dau NTG與Dau G2分別于種子搖瓶培養基中，接種量1ml，于29℃搖床中220rpm培養42h。再轉接到發酵搖瓶培養基中，接種量10%，每個菌株接種9個搖瓶，于28℃搖床中220rpm培養156、168、180h。高壓液相測定效價，每個時間點測定3個搖瓶，結果見表2。

結果表明不論誘變還是基因組改組都能夠提高發酵效價，基因組改組效果最好，其中Dau G22發酵效價最高，最高效價為2254g/L，比原始菌株提高105%。

2.4 融合子的穩定性試驗

選擇效價最高的2個融合子:Dau G21和Dau G22，傳代20次后，進行搖瓶培養發酵，用高壓液相測定發酵效價，測定結果見表3。

結果證明融合子Dau G21和Dau G22遺傳穩定性都很好。

3 結語

我們采用紫外和NTG兩種誘變方法獲得多株突變菌株作為基因組改組的出發菌株擴大了遺傳差異性，融合滅活后的原生質體可以提高融合子的篩選效率，采用遞進式的鏈霉素篩選壓力是優化柔紅霉素產生菌的有效方式，多輪原生質體融合是基因組改組的有效方法。基因組改組技術是提高工業微生物發酵效價的重要手段，有著廣泛的應用前景。

參考文獻

[1]Patnaik R，Louie S，Gavrilovic V，et al. Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance. Nat Biotechnol，2002，20:707～712.

[2]Stephanopoulos G.Metabolic engineering by genome shuffling.Nat Biotechnology， 2002，20:666～668.

[3]Zhang Y X，Perry K，Victor A，et al. Genome shuffing leads to rapid phenotypic improvement in bacteria.Letters to Nature，2002，415:644～646.

[4]Dai M H， Copley S D. Genome shuffling improves degradation of the anthropogenic pesticide Pentachlo RophenolbySphingobium chlorophenolicum ATCC 39723.Appl Environ Microbiol，2004，70:2391～2397.

[5]高雯.抗腫瘤抗生素柔紅霉素產生菌的基因組改組研究.中國優秀碩士論文庫.2005.

[6]劉連碧，曹進新，朱春寶，朱寶泉.鏈霉素抗性篩選法在柔紅霉素產生菌S.coeruleorubidus Var.zhengding SIPI 1482菌種選育中的應用.中國醫藥工業雜志.2000.31(8):345～347.

[7]T Kieser，MJ Bibb， MJ Buttner，KF Chater， DA Hopwood.《practical streptomyces genetics》.Published by the John Innes Foundation.2000.