SSR標記與扁穗牛鞭草農藝性狀關聯分析

摘要：利用ＳＳＲ引物對４４份外部形態差異較大的扁穗牛鞭草基因組進行掃描，結合農藝性狀，進行性狀與標記間的關聯分析。結果表明，①扁穗牛鞭草群體的農藝性狀存在較大變異，其中分蘗數變異最大，變異系數達３４．８％，其次是單株生物量、葉長和莖葉比，變異系數也達２０％以上。②扁穗牛鞭草農藝性狀間存在顯著的相關關系，單株生物量與葉寬、莖直徑、莖長呈極顯著正相關，莖葉比與節間長、莖長呈極顯著正相關，與分蘗數呈極顯著負相關。③通過單向分組資料的方差分析，從１８２條多態性條帶中共檢測到與扁穗牛鞭草８個農藝性狀極顯著相關的ＳＳＲ標記１８個，其中，６個標記分別與２個以上性狀關聯。標記對性狀變異的貢獻率為１５．１％～３２．８％，ＳＧ５－１６０能解釋３２．８％節間長表型變異，引物ＳＧ２５的４個標記對莖直徑表型變異的總貢獻率達９１．６％。該研究結果對早期發現優異種質，縮小篩選范圍，降低篩選成本和工作量，加快扁穗牛鞭草育種進程有重要意義。

關鍵詞：扁穗牛鞭草；ＳＳＲ標記；農藝性狀；關聯分析

中圖分類號：Ｓ５４；Ｑ７８文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1494-05

Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＳＲ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Markers ａｎｄ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ

Ｈｅｍａｒｔｈｒｉａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ

ＣＨＥＮ Ｙｏｎｇ－ｘｉａ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｘｉｎ－ｑｕａｎ２，ＭＡ Ｘｉａｏ２，ＸＩＥ Ｗｅｎ－ｇａｎｇ２

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｘｉｃｈａｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｘｉｃｈａｎｇ ６１５０００，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａ’ａｎ ６２５０００，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ８ ａｇｒｏｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ ４４ Ｈｅｍａｒｔｈｒｉａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｎｄ １０ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＳＳＲ ｐｒｅｍｉｅｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ ｔｒａｉｔｓ ａｎｄ ＳＳＲ ｍｏｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ： ① ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｖａｒｉｏｕｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｍｏｎｇ Ｈ．ｃｏｍｐｒｅｓｓａ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ． Ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｔｉｌｌｅｒｓ ｗａｓ ３４．８％． Ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｂｉｏｍａｓｓ， ｌｅａｆ ｗｉｄｔｈ ａｎｄ ｓｔｅｍ－ｌｅａｆ ｒａｔｉｏ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ２０％． ②Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓｅ ａｇｒｏｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｌｅａｆ ｗｉｄｔｈ， ｓｔｅｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ， ｂｒａｎｃｈ ｌｅｎｇｔｈ， ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｅｍ－ｌｅａｆ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ ｌｅｎｇｔｈ， ｂｒａｎｃｈ ｌｅｎｇｔｈ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔｅｍ－ｌｅａｆ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｔｉｌｌｅｒｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｎｅｇａｔｉｖｅ． ③Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ １８ markers ｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ １８２ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ８ ａｇｒｏｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ， ａｍｏｎｇ ｗｈｉｃｈ ６ markers ｗｅｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ２ ｔｒａｉｔｓ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｆｒｏｍ １５．１％ ｔｏ ３２．８％， ａｎｄ ｔｈｅ ＳＧ５－１６０ ｍａｒｋｅｒ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ３２．８％ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ ｌｅｎｇｔｈ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｆｏｕｒ markers ｏｆ ｐｒｅｍｉｅｒ ＳＧ２５ ｗａｓ ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ ９１．6％ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｗａｓ ｕｓｅｆｕｌ ｔｏ ｆｉｎｄ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ Ｈ． ｃｏｍｐｒｅｓｓａ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｅａｒｌｙ， ｒｅｄｕｃｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ， ｄｅｃｒｅａｓｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃｏｓｔ ａｎｄ ｗｏｒｋｌｏａｄ， ａｎｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｈｅｍａｒｔｈｒｉａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ； ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒ； ａｇｒｏｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ； ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ

扁穗牛鞭草（Ｈｅｍａｒｔｈｒｉａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）為禾本科牛鞭草屬多年生牧草，在我國主要分布在長江以南及河北、山東、陜西等地。扁穗牛鞭草生長期長、生長速度快、抗逆性強、產量高，是熱帶、亞熱帶建植人工草地和南方草山草坡改良的優良草種。目前對扁穗牛鞭草的遺傳多樣性［１－３］、生產性能［４］、繁殖特性［５］等方面進行了較為深入的研究，但對多基因控制的數量性狀位點（ＱＴＬ）定位及與扁穗牛鞭草表型變異相關分子標記的研究，尚未見報道。

關聯分析是一種把候選基因的遺傳變異與目標性狀聯系起來的技術，其理論依據是遺傳標記與性狀的連鎖分析［６］。Ｖｉｒｋ等［７］對４０份具代表性的東南亞水稻種質進行ＲＡＰＤ標記與農藝性狀間的關聯分析，檢測到與水稻的分蘗數、株高、開花期、穗長、葉長和粒寬相關的ＲＡＰＤ標記，其中ＯＰＣ－０８－３４０可以解釋４９．８４％分蘗數變異。后來，在燕麥［８］、大麥［９－１１］、小麥［１２］、馬鈴薯［１３］、桑樹［１４－１６］、楊樹［１７，１８］等植物上，也找到一些與重要性狀緊密相關的標記。但是，在牧草作物上，關聯分析僅見于紫花苜蓿［１９，２０］和早熟禾［２１］。

扁穗牛鞭草結實率相當低，主要采用無性繁殖，關聯分析無需構建專門的作圖群體，為扁穗牛鞭草的ＱＴＬ定位提供了方向。扁穗牛鞭草主要采用傳統育種方法，對表型進行選擇，需要進行多年多點觀測，耗時長效率低。本研究在扁穗牛鞭草表型研究的基礎上，進行ＳＳＲ標記與農藝性狀的關聯分析，篩選與重要農藝性狀緊密關聯的ＳＳＲ分子標記，以期從分子水平解釋扁穗牛鞭草遺傳變異規律和機制，為篩選優異種質、加快育種進程奠定基礎。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１扁穗牛鞭草材料采自四川、重慶、云南、貴州等地不同生境、野生狀態下，外部形態差異明顯的扁穗牛鞭草無性系４１份，及人工草地種植的國審品種“廣益”、“重高”、“雅安”（表1），每個無性系取具２～３個節的莖段種植于直徑為３０ ｃｍ的塑料盆內，每盆１株，５個重復。

１．１．２試劑近緣植物高粱的ＳＳＲ引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；植物ＤＮＡ提取試劑盒、Ｔａｑ酶、１００ ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ購自天根生化科技（北京）有限公司；其他化學試劑購自成都博瑞克生物技術有限公司。

１．２方法

１．２．１ＳＳＲ分子標記取幼嫩扁穗牛鞭草葉片，按植物ＤＮＡ提取試劑盒步驟提取ＤＮＡ。用０．８％的瓊脂糖凝膠檢測ＤＮＡ質量。從５０對ＳＳＲ引物中篩選出條帶清晰、多態性好的１０對引物（表２）進行ＰＣＲ擴增。ＰＣＲ體系及程序按照ＷＡＮＧ的方法［２２］。用６％的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離檢測，照相觀察并記錄結果。

１．２．２農藝性狀測定測定單株生物量、莖葉比、分蘗數、葉長、葉寬、節間長、節直徑、莖長，其中單株生物量、莖葉比、分蘗數為５次重復結果，其他為１５次重復結果。

１．３數據統計分析

對擴增條帶進行統計，在相同的遷移位置，有帶記為“１”，無帶記為“０”，僅記錄清晰強帶和重復性好的弱帶。根據標記帶型的有無將群體劃分為２個亞群體：組１和組０，對農藝性狀進行單因素方差分析和相關分析［２３］，分析軟件為ＳＰＳＳ１５．０。用組間方差與總方差的比值求得標記產生的性狀變異占性狀總變異的百分率，即標記對該性狀變異的貢獻率［１８］。

２結果與分析

２．１農藝性狀的表型變異

研究結果表明，所選擇扁穗牛鞭草群體的農藝性狀存在較大變異（表3），其中分蘗數變異最大，變異系數達３４．８％，其次是單株生物量、葉長和莖葉比，變異系數也達２０％以上，葉寬、節間長、莖直徑、莖長也存在不同程度的變異，變異系數分別為14.4%、17.3%、16.3%、16.2%。扁穗牛鞭草葉片最長為２８．９ ｃｍ，最短為１０．４ ｃｍ；葉片寬度最大值為０．９７６ ｃｍ，最小值為０．４７５ ｃｍ；節間最長為１０．１ ｃｍ，最短為５．１ ｃｍ；莖直徑最大為０．５７１ ｃｍ，最小為０．２７８ ｃｍ；莖最長為１２４．２ cｍ，莖最短為６３．１ cｍ；單株分蘗數最多達２２７．３個，最少達４５．３個；單株生物量最高達９１３．３６ ｇ，最少僅為２８１．３４ ｇ；莖葉比最高為５．１，最低為２．３。

２．２農藝性狀表型相關

對農藝性狀進行相關分析，結果表明，扁穗牛鞭草的農藝性狀間均存在顯著或極顯著相關。對牧草育種來說，單株生物量和莖葉比是最重要的兩個指標。從表４可知，扁穗牛鞭草單株生物量與葉寬、莖直徑、莖長呈極顯著正相關，莖葉比與節間長、莖長呈極顯著正相關，與分蘗數呈極顯著負相關。利用單株生物量和莖葉比與形態指標的相關關系，可對扁穗牛鞭草種質進行初步篩選，選擇符合育種目標的種質作為進一步育種的材料。

２．３ＳＳＲ標記與性狀的關聯分析

采用１０對ＳＳＲ引物，共擴增出２２０條清晰、重復性好的條帶，片段大小為５０～４００ ｂｐ，其中多態性條帶為１８２條，多態率為８２．７％，如ＳＧ５引物對的擴增結果，見圖１。標記位點與數量性狀的關聯分析采用單向分組資料的方差分析方法，即根據標記帶型的有無將群體劃分為兩個亞群體——組１和組０，然后進行單因素方差分析，獲得與數量性狀相關聯的標記位點。通過單向分組資料的方差分析（表5），共檢測到與扁穗牛鞭草農藝性狀極顯著相關的ＳＳＲ標記１８個，其中有６個標記分別與２個以上性狀關聯，分別是ＳＧ５－１６０（葉長、節間長、莖長）、

ＳＧ１５－１２７（葉寬、節間長、莖直徑）、ＳＧ２５－１５７（葉長、葉寬、莖直徑）、ＳＧ７－２２０（分蘗數、單株生物量）、ＳＧ２５－１３６（葉寬和莖直徑）、ＳＧ２６－１６７（節間長、莖長）。單個性狀關聯的標記在１～７個之間，莖直徑和單株分蘗數關聯的標記最多，分別為７個和６個；其次，葉寬、節間長、莖長、葉長關聯的標記分別是４個、３個、３個和２個，單株生物量和莖葉比關聯的標記均為１個。每個標記對性狀變異的貢獻率為１５．１％～３２．８％，ＳＧ５－１６０能解釋３２．８％節間長表型變異，引物ＳＧ２５的ＳＧ２５－１５７、ＳＧ２５－１３６、ＳＧ２５－１２５和ＳＧ２５－１１８ ４個標記對莖直徑表型變異的總貢獻率達９１．６％。

３結論與討論

目前，對多基因控制的數量性狀位點（ＱＴＬ）的研究均是利用兩個具有多態性的種源（或家系）構建分離群體進行研究，但是這種人工創造的作圖群體所含的優良目標基因有限，構建群體耗時，效率低［６］，而且對于無性繁殖的扁穗牛鞭草等植物，幾乎不可能得到這樣的分離群體。本研究采用野生扁穗牛鞭草無性系進行分子標記與數量性狀間的關聯分析，不僅避免了單一分離群體不易獲得的局限性，而且由于野生扁穗牛鞭草無性系來源廣泛、遺傳背景復雜，可能聚集較多的性狀基因，從而有望全面而系統地揭示出與扁穗牛鞭草農藝性狀相關的ＱＴＬ。本研究中，某些標記同時與多個性狀相關聯，如ＳＧ５－１６０與葉長、節間長、莖長關聯，ＳＧ１５－１２７與葉寬、節間長、莖直徑關聯，且各農藝性狀間也彼此相關。性狀的相互關聯可能是由于控制該性狀的ＱＴＬ相互連鎖或是某個ＱＴＬ的一因多效造成的，同一標記與多個相關性狀的關聯可能是數量性狀間在遺傳上相關造成的［２４］。

連鎖不平衡（Ｌｉｎｋａｇｅ ｄｉｓｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ，ＬＤ）程度決定關聯分析的精度和所需標記的數量、密度。通常異花授粉植物重組率高，ＬＤ衰減較快，需要較多的標記；而自花授粉植物，特別是閉花授粉植物，ＤＮＡ多態性偏低，重組率低，ＬＤ衰減距離大，關聯分析所需要的標記少［２５］。本研究從２２０個ＳＳＲ標記中找到１８個標記與農藝性狀極顯著相關，這與扁穗牛鞭草依靠無性繁殖、ＬＤ衰減慢、ＬＤ程度較高、所采用的ＳＳＲ標記可能覆蓋了大部分基因組有關。

農藝性狀是受多基因控制的數量性狀，且各性狀間均有一定的關聯，通過常規育種技術對農藝性狀進行改良往往效果不顯著，且周期長。在ＤＮＡ水平上利用分子標記輔助選擇育種對農藝性狀、抗性等重要性狀進行早期選擇是很有前景的領域。本研究采用ＳＳＲ分子標記對扁穗牛鞭草材料進行掃描，發現１８個與扁穗牛鞭草農藝性狀關聯的標記，其中ＳＧ５－１６０對節間長變異的貢獻率達３２．８％，引物ＳＧ２５的４個標記（ＳＧ２５－１５７、ＳＧ２５－１３６、ＳＧ２５－１２５和ＳＧ２５－１１８）對莖直徑表型變異的總貢獻率達９１．６％。利用與主要農藝性狀關聯的標記可對大量扁穗牛鞭草種質進行篩選，可在早期發現優異種質，降低成本和工作量，這在扁穗牛鞭草新品種培育中有重要意義。

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［２０］ ＭＡＵＲＥＩＲＡ－ＢＵＴＬＥＲ Ｉ Ｊ，ＵＤＡＬＬ Ｊ Ａ，ＯＳＢＯＲＮ Ｔ Ｃ． Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉ－ｐａｒｅｎｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｄｉｖｅｒｓｅ ａｌｆａｌｆａ ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ：Ｔｅｓｔｃｒｏｓｓ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ－ＤＮＡ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ，２００７，１１５（６）：８５９－８６７．

［２１］ ＰＡＢＬＯ Ｆ，ＣＡＶＡＧＮＡＲＯ，ＪＵＡＮ Ｂ，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ｆｏｒａｇｅ ｇｒａｓｓ Ｔｒｉｃｈｌｏｒｉｓ ｃｒｉｎｉｔａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＡＦＬＰ ｍａｒｋｅｒｓ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ，ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｇｒｏｎｏｍｉｃ ｔｒａｉｔｓ［Ｊ］． Ｇｅｎｏｍｅ，２００６，４９（８）：９０６－９１８．

［２２］ ＷＡＮＧ Ｍ Ｌ，ＢＡＲＫＬＥＹ Ｎ Ａ，ＹＵ Ｊ Ｋ，ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ （ＳＳＲ） ｍａｒｋｅｒ ｆｒｏｍ ｍａｊｏｒ ｃｅｒｅａｌ ｃｒｏｐｓ ｔｏ ｍｉｎｏｒ ｇｒａｓｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｆｏｒ ｇｅｒｐｌａｓｍ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，２００５，３（１）：４５－５７．

［２３］ 黃秦軍，丁明明，張香華，等． ＳＳＲ標記與歐洲黑楊材性性狀的關聯分析［Ｊ］．林業科學，２００７，４３（２）：４３－４７．

［２４］ 徐云碧，朱立煌． 水稻形態性狀與分子標記的相互關聯及其檢測［Ｊ］． 浙江農業學報，１９９４，６（１）：１－６．

［２５］ 楊小紅， 嚴建兵，鄭艷萍，等． 植物數量性狀關聯分析研究進展［Ｊ］． 作物學報，２００７，３３（４）：５２３－５３０．