Fe²⁺對(duì)雄性泥鰍生殖毒性的研究

摘要：以泥鰍（Ｍｉｓｇｕｒｎｕｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ）精子為受試材料，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助精子分析（ＣＡＳＡ）系統(tǒng)，研究了亞鐵離子（Ｆｅ２＋）對(duì)雄性泥鰍的生殖毒性。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置３０、６０和３００ μｍｏｌ／Ｌ ３個(gè)Ｆｅ２＋濃度梯度。泥鰍精子暴露０、０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，測(cè)定運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)、時(shí)間和速度等精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。結(jié)果表明，６０ ｍｏｌ／Ｌ的Ｆｅ２＋溶液明顯影響泥鰍的精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間和相對(duì)速度（Ｐ＜０．０５）。高濃度的Ｆｅ２＋能夠抑制泥鰍精子運(yùn)動(dòng)，對(duì)泥鰍具有潛在生殖毒性作用。

關(guān)鍵詞：亞鐵離子（Ｆｅ２＋）；泥鰍；精子運(yùn)動(dòng)；生殖毒性

中圖分類號(hào)：Ｒ９９４．６文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）07－1444-03

Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｂｏｕｔ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｆｅ２＋ ｔｏ ｔｈｅ Male Ｌｏａｃｈ，

Ｍｉｓｇｕｒｎｕｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ

ＣＨＥＮ Ｙｕ-ｍｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｊｉｅ，ＷＡＮＧ Ｙｕｅ-ｗｅｎ，ＨＵ Ｊｉａ-ｈｕｉ，ＣＨＥＮ Ｆｅｎｇ-ｍｅｉ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ ２５２０５９，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｆｅ２＋ ｏｎ ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｏｆ ｌｏａｃｈ（Ｍｉｓｇｕｒｎｕｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ） ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ａ Cｏｍｐｕｔｅｒ－Aｓｓｉｓｔｅｄ Sｅｍｅｎ Aｎａｌｙｚｅｒ （ＣＡＳＡ）． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｌｏａｃｈ ｓｐｅｒｍ ｗａｓ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｉｎ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｆｅ２＋ （３０， ６０， ａｎｄ ３００ μｍｏｌ／Ｌ） ｆｏｒ ０， ０．５， １.0， ２.0 ａｎｄ ４.0 ｈ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ， ｄｕｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｏｆ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｒｏｎ ｉｏｎ ｏｆｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｒｅｄｕｃｅｄ significantly ａｔ ６０ ｍｏｌ／Ｌ ｏｆ Ｆｅ２＋（Ｐ＜０．０５）． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｒｏｕｓ ｉｏｎｓ ｗｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄａｍａｇｅ ｔｈｅ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏａｃｈ， ａｎｄ ｍｉｇｈｔ ｈａｖｅ ｈａｒｍｆｕｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｌｏａｃｈ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｆｅｒｒｏｕｓ ｉｏｎ； ｌｏａｃｈ； ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ； ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ

鐵是動(dòng)物體內(nèi)必需的微量元素，是血紅素、細(xì)胞色素的重要組成部分，可參與多種生命活動(dòng)過(guò)程，機(jī)體內(nèi)的鐵代謝平衡是保證生命活動(dòng)正常進(jìn)行的基礎(chǔ)［１］。隨著現(xiàn)代化進(jìn)程的加快，鐵礦業(yè)的膨脹和工業(yè)廢水排放的增加，水環(huán)境中鐵離子濃度呈升高趨勢(shì)［２］。水環(huán)境中鐵濃度的升高已對(duì)生物的生存及生物多樣性產(chǎn)生了嚴(yán)重影響，對(duì)敏感物種的危害更大［３］。

對(duì)生活在污染水體中的淡水魚而言，成熟配子排入水中后，直接與水環(huán)境中的污染物接觸，首先使配子受到傷害，進(jìn)而降低受精率和孵化率，還會(huì)對(duì)幼體發(fā)育產(chǎn)生重大影響。近年來(lái)，以動(dòng)物的精子為靶細(xì)胞，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助精子分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｓｅｍｅｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＣＡＳＡ），對(duì)水體中的多種重金屬的毒性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)汞、錫、鉛、鎘和鋁等重金屬均能誘導(dǎo)精子細(xì)胞發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)、降低精子活力和受精率，并影響子代的正常發(fā)育［４－１０］。到目前為止，人們更多關(guān)注鐵離子對(duì)哺乳動(dòng)物和人類生殖毒性的研究［１１，１２］，尚未見對(duì)淡水魚精子細(xì)胞毒性的報(bào)道。我們首次應(yīng)用ＣＡＳＡ技術(shù)來(lái)研究不同F(xiàn)e2+濃度處理對(duì)泥鰍（Ｍｉｓｇｕｒｎｕｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｃａｕｄａｔｕｓ）精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響，為進(jìn)一步了解Fe2+對(duì)淡水硬骨魚的生殖毒性作用及對(duì)水生態(tài)環(huán)境的影響提供理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用泥鰍購(gòu)于聊城市交運(yùn)大市場(chǎng)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，先在１０ ｍｇ／Ｌ的ＫＭｎＯ４溶液中浸泡１０ min殺菌消毒，在玻璃缸（６０ ｃｍ×２５ ｃｍ×３５ ｃｍ）內(nèi)飼養(yǎng)兩周后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣３ ｄ以上的自來(lái)水，連續(xù)充氣，每天換約１／５體積的水。

１．２試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)用硫酸亞鐵（ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）、氯化鉀（ＫＣｌ）和氯化鈉（ＮａＣｌ）等化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)買于南京南奧科技有限公司。實(shí)驗(yàn)參照Ｍáｒｒｉáｎ等［１３］的方法并加以改進(jìn)，用雙蒸水配制精子保存液和激活液母液。精子保存液母液含１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２和１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ６．５），滲透壓為３３０ ｍＯｓｍ／ｋｇ。精子激活液母液含６０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２和１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ６．５），滲透壓為１５０ ｍＯｓｍ／ｋｇ。分別用保存液和激活液母液配制Ｆｅ２＋終濃度為３０、６０和３００ μｍｏｌ／Ｌ的保存液和激活液。

１．３精子的收集與處理

取健康的性成熟泥鰍，先在清水中沖洗，然后用吸水紙吸去魚體表面的水。稱重和測(cè)體長(zhǎng)后，解剖取精巢。實(shí)驗(yàn)用魚的平均體重是（８．６２±０．５４）ｇ，平均體長(zhǎng)為（１２．８８±０．４４）ｃｍ，精巢平均重量（０．０６３ ２± ０．００２ ８）ｇ。按１∶１０（Ｗ∶Ｖ，g∶mL）將精巢放在保存液中，用眼科剪剪碎，讓精液溢出，然后離心１ ｍｉｎ（２００ ｒ／ｍｉｎ），棄去組織碎塊加入少量保存液、計(jì)數(shù)，制成精子懸液（密度約為１０７個(gè)／ｍＬ）。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)暴露０、０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后檢測(cè)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。

１．４精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)檢測(cè)

分別取５ μＬ精子懸液，置于干凈載玻片上，迅速用４５ μＬ相應(yīng)濃度的鐵離子激活液混合，混合１０ ｓ后，精子已被充分激活。在光學(xué)顯微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１，Ｊａｐａｎ）下觀察（×４００）和記錄精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。①精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間：從激活開始，到精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)減少到２０％時(shí)所用的時(shí)間；②精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)：同一視野中，運(yùn)動(dòng)精子數(shù)與全體精子總數(shù)的百分比；③精子運(yùn)動(dòng)速度：精子細(xì)胞位移與時(shí)間比；④相對(duì)平均速度：不同濃度處理的精子運(yùn)動(dòng)速度與對(duì)照組精子速度的比。精子激活后每隔１ ｍｉｎ記錄一次運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)，并拍攝。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)３次，每次隨機(jī)選擇３個(gè)視野，在對(duì)照組中，最大精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)低于９０％的精子懸液樣本，不作記錄。

１．５統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Ｅｘｃｅｌ和ＳＰＳＳ １３．０統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用ｔ檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著差異水平為Ｐ＜０．０５。

２結(jié)果

２．１不同Ｆｅ２＋濃度對(duì)泥鰍精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)的影響

在對(duì)照組中，精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)是９５％，暴露２.0和４.0 ｈ后激活，精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)分別是９５％和９０％。在６０ μｍｏｌ／Ｌ的Ｆｅ２＋溶液中暴露１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，泥鰍精子的運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)分別為９２％、９０％和８６％；在３００ μｍｏｌ／Ｌ的Ｆｅ２＋溶液中激活，運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)是９１％，暴露０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)分別變?yōu)椋梗埃?、８６％、８５％和６５％。由圖１知，Ｆｅ２＋對(duì)泥鰍精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)影響較小，僅在高濃度組（３００ μｍｏｌ／Ｌ）出現(xiàn)顯著差異；隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，精子運(yùn)動(dòng)百分?jǐn)?shù)在４.0 ｈ（６０ μｍｏｌ／Ｌ暴露組）時(shí)出現(xiàn)明顯降低。

２．２不同Ｆｅ２＋濃度對(duì)泥鰍精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響

在對(duì)照組中，泥鰍精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間為３３０ ｓ；暴露０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別為３６０、３２５、３１８和２９５ ｓ。在３０ μｍｏｌ／Ｌ Ｆｅ２＋溶液中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間是３１６ ｓ，暴露０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，分別是３０８、２８５、２８０和２７０ ｓ。在６０ μｍｏｌ／Ｌ Ｆｅ２＋的溶液中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間是２７０ ｓ，暴露０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，分別是２７５、２６５、２４０和２５８ ｓ。在３００ μｍｏｌ／Ｌ Ｆｅ２＋的溶液中的運(yùn)動(dòng)時(shí)間是２５５ ｓ，暴露０．５、１.0、２.0和４.0 ｈ后激活，分別是２５９、２３３、２３８和１８５ ｓ。由圖２可知，隨暴露濃度的升高，泥鰍精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間呈縮短趨勢(shì)，并隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而縮短。

２．３不同Ｆｅ２＋濃度對(duì)泥鰍精子運(yùn)動(dòng)相對(duì)速度的影響

由圖３可知，在所有暴露時(shí)間中，６０和３００ μｍｏｌ／Ｌ的Ｆｅ２＋明顯降低了泥鰍精子的相對(duì)速度，并隨著暴露濃度的增高而顯著降低；而３０ μｍｏｌ／Ｌ Ｆｅ２＋僅在暴露４.0 ｈ后對(duì)相對(duì)速度影響明顯。在２.0 ｈ的暴露時(shí)間內(nèi)，所有實(shí)驗(yàn)組泥鰍精子的相對(duì)速度沒有發(fā)生明顯變化；但當(dāng)暴露時(shí)間延長(zhǎng)到４.0 ｈ時(shí)，經(jīng)Ｆｅ２＋暴露的所有泥鰍精子的相對(duì)速度顯著降低。

３討論

一般認(rèn)為，重金屬對(duì)動(dòng)物的毒性作用與細(xì)胞質(zhì)膜過(guò)氧化有關(guān)。機(jī)體內(nèi)的鐵主要以化合物的形式存在，當(dāng)體內(nèi)游離的鐵過(guò)量時(shí)，會(huì)通過(guò)Ｆｅｎｔｏｎ反應(yīng)產(chǎn)生氧自由基［１４，１５］，過(guò)量的自由基不僅會(huì)損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和ＤＮＡ等生物大分子［１６，１７］，還對(duì)線粒體進(jìn)行攻擊。在本研究中，６０ μｍｏｌ／Ｌ及以上濃度的Ｆｅ２＋溶液明顯影響了泥鰍精子的運(yùn)動(dòng)時(shí)間和速度。精子運(yùn)動(dòng)速度和持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短，是影響受精率的重要參數(shù)。可見，Ｆｅ２＋對(duì)泥鰍精子具有生殖毒性。暴露時(shí)間較短時(shí)，低濃度組精子各運(yùn)動(dòng)參數(shù)的變化較小，４.0 ｈ后精子運(yùn)動(dòng)能力才明顯降低?？梢娫诙虝r(shí)間內(nèi)，低濃度Ｆｅ２＋的毒性是較弱的。在暴露０．５ ｈ時(shí)，泥鰍精子表現(xiàn)出最強(qiáng)的活力，其產(chǎn)生原因及對(duì)受精和發(fā)育的影響有待進(jìn)一步研究。

《煤炭工業(yè)污染物的排放標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)鐵的要求是低于１２５ μｍｏｌ／Ｌ（７ ｍｇ／Ｌ），高于我們研究中顯著影響精子運(yùn)動(dòng)能力的濃度。工業(yè)廢水在沒有經(jīng)過(guò)進(jìn)一步處理直接排入河流和湖泊時(shí)，處于排放口附近的魚類的生殖和發(fā)育很可能會(huì)受到嚴(yán)重的影響。近期，劉時(shí)東［１８］對(duì)河南某礦井調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)氐V井排放的廢水中鐵離子濃度嚴(yán)重超標(biāo)（達(dá)１１ ６００ μｍｏｌ／Ｌ），已使湄水河受到嚴(yán)重污染。

總之，過(guò)量的Ｆｅ２＋能降低泥鰍精子的運(yùn)動(dòng)能力，對(duì)泥鰍的生殖具有潛在的毒性作用。因此，Ｆｅ２＋對(duì)水環(huán)境的污染和其潛在的生殖毒性需要引起人們足夠重視和關(guān)注，其對(duì)淡水硬骨魚精子細(xì)胞的毒性作用機(jī)制更需深入研究。

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［１２］ ＨＵＡＮＧ Ｙ Ｌ， ＴＳＥＮＧ Ｗ Ｃ， ＬＩＮ Ｔ Ｈ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ （Ｆｅ２＋，Ｍｎ２＋，Ｐｂ２＋） ｏｎ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｍｅｎ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ， Ｐａｒｔ Ａ，２００１，６２（４）：２５９-２６７．

［１３］ Ｍ?魣ＲＩ?魣Ｎ Ｔ， ＫＲＡＳＺＮＡＩ Ｚ， ＢＡＬＫＡＹ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ ｉｎ ｃａｒｐ ｓｐｅｒｍ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｓｉｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａ＋／Ｈ＋ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ［Ｊ］． Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１９９７，２７：３７４-３８２．

［１４］ ＥＡＴＯＮ Ｊ Ｗ， ＱＩＡＮ Ｍ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｒｏｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ［Ｊ］． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００２，３２（９）：８３３－８４０．

［１５］ ＦＯＲＥＳＴＩ Ｅ， ＦＯＲＭＥＲＯ Ｅ， ＬＥＳＣＩ Ｉ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ａｓｂｅｓｔｏｓ ｈｅａｌｔｈ ｈａｚａｒｄ： Ａ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｏｉｎｓｐｉｒｅｄ Ｆｅ－ｄｏｐｅｄ ｃｈｒｙｓｏｔｉｌｅ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｚａｒｄｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００９，１６７ （１-３）：１０７０-１０７９．

［１６］ ＭＥＮＥＧＨＩＮＩ Ｒ． Ｉｒｏｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ， ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ， ａｎｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ［Ｊ］． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９７，２３（５）：７８３-７９２．

［１７］ ＶＡＬＥＮＴＩＮＥ Ｊ Ｓ， ＷＥＲＴＺ Ｄ Ｌ， ＬＹＯＮＳ Ｔ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｄａｒｋ ｓｉｄｅ ｏｆ ｄｉｏｘｙｇｅｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９８，２（２）：２５３-２６２．

［１８］ 劉時(shí)東． 煤礦開采水污染調(diào)查與控制對(duì)策［Ｊ］． 環(huán)境保護(hù)，２０１０（９）：４９－５０．