靜脈灌注LPS對家兔的發(fā)熱效應(yīng)及肝蛋白的SDS-PAGE比較分析

摘要：以靜脈注射內(nèi)毒素（ＬＰＳ）的方法建立了家兔發(fā)熱模型，并以白虎湯的降溫治療作為反證，再運(yùn)用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝膠電泳比較和分析了ＬＰＳ引起的發(fā)熱效應(yīng)對家兔肝臟總蛋白表達(dá)變化的影響以及肝組織病理變化。結(jié)果表明，以１５ μｇ／ｋｇ體重的ＬＰＳ靜脈注射家兔能很好地復(fù)制出動(dòng)物溫病模型，模型組、治療組和對照組３組動(dòng)物的肝蛋白表達(dá)均有各自的特異條帶。所以，肝組織蛋白的表達(dá)變化可以作為動(dòng)物溫病研究與評(píng)價(jià)的生物學(xué)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：ＬＰＳ；發(fā)熱模型；白虎湯；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；蛋白差異表達(dá)

中圖分類號(hào)：Ｓ８５３．１；Ｓ８５３．２１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）07－1416-04

Ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＬＰＳ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｖｅｉｎｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ

ＺＨＡＮＧ Ｓｈｉ－ｄｏｎｇ１，ＬＩ Ｓｈｉ－ｈｏｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｄｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ１，ＧＯＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｚｈｅｎ２，ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ１，

ＬＩ Ｊｉｎ－ｙｕ１，ＬＩ Ｘｉａ１，ＹＡＮ Ｚｕｏ－ｔｉｎｇ１

（１． Ｌａｎｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅs ／ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＣＡＡＳ／Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００５０， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＬＰＳ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ｖｅｉｎｓ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｉｚｅｄ ａｎｄ Ｂａｉｈｕ Ｓｏｕｐ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｆｅｖｅｒ ａｓ ｃｏｕｎｔｅｒｅｖｉｄｅｎｃｅ． Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＬＰＳ ｆｅｖｅｒ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｅｖｅｒ ｍｏｄｅｌ ｃａｎ ｂｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ ｂｙ １５μｇ／ｋｇ ＬＰＳ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎｔｏ ｖｅｉｎｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ， ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｗｅｉｇｈｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ， ＬＰＳ－ｉｎｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｂａｉｈｕ Ｓｏｕｐ ｔｒｅａｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｆｅｖｅｒ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＬＰＳ； ｆｅｖｅｒ ｍｏｄｅｌ； Ｂａｉｈｕ Ｓｏｕｐ； ＳＤＳ－ＰＡＧＥ； ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

溫病為外感熱病。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的傳染性與感染性疾病多屬溫病范疇，其臨床多以發(fā)熱為主癥［１］。溫病動(dòng)物模型的建立及試驗(yàn)研究對于揭示急性外感熱病的本質(zhì)以及提高其治療手段都有重要的意義，而白虎湯作為清熱生津、溫病治療的經(jīng)典方，對高熱癥的實(shí)用價(jià)值被普遍公認(rèn)［２，３］。本研究建立了家兔溫病模型，并以白虎湯作降溫治療，用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝膠電泳比較分析了家兔肝臟組織蛋白的表達(dá)變化，為溫病研究提供了一定的理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１主要試劑丙烯酰胺（Ａｃｒ）、Ｎ，Ｎ’－甲叉雙丙烯酰胺（Ｂｉｓ）、過硫酸銨（ＡＰ）、四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、β－巰基乙醇、甘氨酸、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)Ｒ２５０等購自Ｓｉｇｍａ公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自天根生化科技（北京）有限公司；脂多糖（ＬＰＳ，Ｏ５５：Ｂ５）購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。白虎湯由石膏、知母、粳米、甘草組成，普通煎煮，并制成１ ｇ／ｍＬ的口服液。

１．１．２試驗(yàn)動(dòng)物新西蘭兔１８只，普通級(jí)，雌雄不限，單籠飼養(yǎng)，平均體重２．０ ｋｇ，體重變異不超過平均體重的２０％，試驗(yàn)動(dòng)物及飼料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)并測溫３ ｄ，以適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境與測溫操作。

１．１．３儀器高速冷凍離心機(jī)，ＤＹＹ－６Ｃ型電泳儀（北京六一儀器廠），ＦＤ－１Ｂ－５０型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），垂直電泳槽，脫色搖床，酸度計(jì)，分析天平等。

１．２溫病模型的建立

將１８只兔隨機(jī)分為３組，每組６只。其中Ａ組為對照，注射生理鹽水；Ｂ組以１５ μｇ／ｋｇ ＬＰＳ靜脈灌注（模型組）；Ｃ組為１５ μｇ／ｋｇ ＬＰＳ靜脈灌注，同時(shí)灌服白虎湯治療（７ ｍＬ／ｋｇ），Ａ組、Ｂ組均灌服生理鹽水（７ ｍＬ／ｋｇ）。觀察各組動(dòng)物體征變化，并每０．５ ｈ記錄肛溫１次。于試驗(yàn)前連續(xù)測肛溫３次，取平均值為基礎(chǔ)體溫。注射ＬＰＳ ２．５ ｈ后，以空氣栓塞法處死模型組動(dòng)物，６ ｈ后治療組再次灌服白虎湯（７ ｍＬ／ｋｇ），次日以空氣栓塞法處死剩下的２組動(dòng)物。

１．３臟器變化及肝組織切片的制備

處死動(dòng)物后，解剖并觀察皮下出血情況及心、肝、肺、脾、腎、小腸等主要臟器的病理變化。取適量肝組織，經(jīng)生理鹽水漂洗后，固定于福爾馬林溶液中，經(jīng)常規(guī)切片及ＨＥ染色后，觀察肝臟組織病理變化。

１．４蛋白樣品的制備

處死動(dòng)物后取適量肝組織，經(jīng)生理鹽水漂洗后，加入４倍體積生理鹽水和一定量的石英砂，在４℃下研磨粉碎，然后將勻漿液煮沸５ ｍｉｎ，于４℃

１１ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，取上清液在－７０℃凍存

２４ ｈ后，于－５５℃、８０Ｍｐａ下真空干燥２８ ｈ。試驗(yàn)前，將干燥樣品用生理鹽水溶解為１０ μｇ／μL，電泳上樣量為３０ μＬ／ｌａｎｅ。

１．５ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝膠電泳

根據(jù)ＬａｅｍｍＬｉ的方法進(jìn)行垂直電泳［４］。分離膠和濃縮膠分別為１０％和４％，電泳緩沖液為Ｔｒｉｓ－甘氨酸－ＳＤＳ（ｐＨ值為８．３）。穩(wěn)流電泳，濃縮膠和分離膠電流分別為１０ｍＡ和１５ｍＡ，經(jīng)過大約４ ｈ停止電泳，考馬斯亮藍(lán)Ｒ２５０常規(guī)染色，乙醇－冰乙酸脫色后制成干膠板，掃描成像，并重復(fù)電泳３次。

２結(jié)果

２．１動(dòng)物癥狀與體征變化

注射ＬＰＳ后，Ｂ組動(dòng)物體溫逐漸升高，精神沉郁，并出現(xiàn)蜷縮、發(fā)抖、聳毛、呼吸和心率加快等癥狀。至２．５ ｈ左右，發(fā)熱愈加明顯，精神較倦怠，蜷縮逐漸消失，發(fā)抖消失，皮毛濕潤，呼吸急促，心率更快，耳廓血管擴(kuò)張發(fā)紅，眼結(jié)膜充血明顯，部分動(dòng)物舌質(zhì)偏紅，但神志清醒，拒食，少數(shù)動(dòng)物有稀便。以白虎湯治療的動(dòng)物（Ｃ組）體溫升高緩慢，蜷縮、發(fā)抖、聳毛、呼吸和心率加快，但與Ｂ組相比，癥狀明顯減輕。對照動(dòng)物（Ａ組）表現(xiàn)正常，無明顯上述病癥。

２．２體溫凈增值變化

注射ＬＰＳ和經(jīng)白虎湯治療后，處理組動(dòng)物的體溫都明顯升高，與注射生理鹽水的空白對照組比較有顯著的差異（P＜0.05），且在２ ｈ以后，白虎湯治療組動(dòng)物的體溫出現(xiàn)明顯的回落（圖１）。

２．３臟器及肝組織病理切片觀察

與對照組動(dòng)物（Ａ組）比較，靜脈注射ＬＰＳ的動(dòng)物皮下有出血點(diǎn)；心臟淤血；肝臟顏色發(fā)黑，部分動(dòng)物肝臟表面有散在粟粒狀小膿腫；脾臟腫脹，充血，有淤血斑；肺臟有淤血，多數(shù)可見大小不等、多少不一的點(diǎn)片狀出血；腎臟腫脹有淤血斑，髓質(zhì)部有出血；胃黏膜嚴(yán)重脫落，黏膜下層出血；小腸內(nèi)積有黃色黏液。經(jīng)白虎湯治療的動(dòng)物肝臟顏色加深發(fā)黑、脾臟輕微腫脹、肺臟和腎臟等無明顯充血。

經(jīng)肝臟病理檢查（圖２），對照組（Ａ組）動(dòng)物肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝小葉清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核明顯，肝小葉間間質(zhì)清晰，個(gè)別樣品有輕度淤血。模型組（Ｂ組）動(dòng)物肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞廣泛水泡變性，嚴(yán)重時(shí)，肝細(xì)胞壞死、崩解，小葉間間質(zhì)淤血，膽管周圍有炎癥細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)內(nèi)見較多淋巴細(xì)胞浸潤，且小膽管增生。白虎湯治療組（Ｃ組）與對照組（Ａ組）比較各組織器官仍有程度不等的損傷性變化，但與模型組（Ｂ組）比較變化轉(zhuǎn)輕，肝小葉結(jié)構(gòu)輕度損傷，肝細(xì)胞索排列較清晰，肝細(xì)胞輕度顆粒變性，小葉間間質(zhì)淤血。

２．４低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線

根據(jù)蛋白質(zhì)在電泳當(dāng)中其分子量的對數(shù)值與其相對遷移率呈比例關(guān)系的原理［５］，利用已知分子量蛋白質(zhì)在膠板上的遷移距離，計(jì)算相對遷移率，以分子量對相對遷移率作圖，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上測定其分子量。根據(jù)ＳＤＳ電泳結(jié)果，參照說明書中所給蛋白質(zhì)的分子量（１９～１１７ ｋＤａ），以蛋白質(zhì)分子量對數(shù)為縱坐標(biāo)、相對遷移率為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖３）。

２．５肝臟組織的蛋白表達(dá)圖譜

各組動(dòng)物的肝臟組織蛋白經(jīng)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳后結(jié)果如圖４所示。由圖４可見，條帶１為Ａ組特有；條帶２在Ｂ、Ｃ組中表達(dá)減弱；條帶３在Ａ組中表達(dá)顯著，而在Ｂ組和Ｃ組中不顯著；條帶４在Ａ組中呈強(qiáng)表達(dá)，而在Ｂ組和Ｃ組中表達(dá)較弱，且它們的強(qiáng)度相似；條帶５和６在Ａ組中都有表達(dá)，但在Ｂ組中無顯著表達(dá)，而在Ｃ組中又恢復(fù)表達(dá)，且與Ａ組相比表達(dá)有增強(qiáng)；條帶７在Ａ組和Ｃ組中表達(dá)量較相似，而在Ｂ組中表達(dá)較弱；條帶９在Ｂ組和Ｃ組中皆有表達(dá)，而Ａ組中無此條帶。其他條帶在３組中均無明顯的表達(dá)差異，比如條帶８在各組中都呈相似表達(dá)。進(jìn)一步分析比較可發(fā)現(xiàn)，條帶１、３只在Ａ組中有，而ＬＰＳ作用后的Ｂ、Ｃ組中表達(dá)不顯著，說明該蛋白的表達(dá)可被ＬＰＳ作用抑制，且白虎湯治療不能使其恢復(fù)表達(dá)；條帶５、６經(jīng)ＬＰＳ作用抑制表達(dá)后，白虎湯的治療則可使其恢復(fù)表達(dá)；條帶９在Ａ組中本無表達(dá)，而在Ｂ、Ｃ兩組中均有表達(dá)，說明此蛋白經(jīng)ＬＰＳ作用后發(fā)生了“記憶”表達(dá)，因?yàn)樵冢媒M中白虎湯的作用并不能消除其表達(dá)。

３討論

在傳染性疾病嚴(yán)重威脅動(dòng)物健康的今日，中醫(yī)溫病學(xué)研究的重要性不言而喻。溫病試驗(yàn)動(dòng)物模型的制作方法大體分為兩類：一類是使用病原微生物；另一類是使用其他致熱源，其中較常用者為內(nèi)毒素（ＬＰＳ）。ＬＰＳ是一種重要的致熱原，微量內(nèi)毒素就能引起體溫上升［６］。從試驗(yàn)結(jié)果來看，靜脈注射１５ μｇ／ｋｇ的ＬＰＳ使得家兔體溫顯著升高，機(jī)體臟器發(fā)生明顯的病理變化，而白虎湯的治療也能起到顯著的降溫及治愈效果。因此，利用ＬＰＳ能很好地復(fù)制出動(dòng)物溫病模型。

從ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的結(jié)果對比可以看到，３組試驗(yàn)動(dòng)物肝臟蛋白的表達(dá)都存在顯著差異，各組均有特異表達(dá)的蛋白，且一些分子量相似或相同的蛋白在不同處理組中表達(dá)量也有顯著差異。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的差異表達(dá)反映著細(xì)胞中基因的差異表達(dá)，所以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的結(jié)果表明，靜脈注射ＬＰＳ可影響家兔肝臟組織的基因表達(dá)，且白虎湯的降溫治療作用也可影響或改變ＬＰＳ造成的基因表達(dá)變化。肝臟是介于腹腔消化道與機(jī)體大循環(huán)之間一個(gè)重要的防衛(wèi)器官，其在血液循環(huán)中處于關(guān)鍵位置，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用［７］。靜脈注射后， ＬＰＳ首先到達(dá)肝臟，肝臟在受到ＬＰＳ刺激時(shí)，釋放出免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)以調(diào)節(jié)肝臟本身乃至全身的免疫機(jī)能［８］。因此，蛋白的差異表達(dá)變化也可能是肝臟組織中一些免疫基因受到調(diào)控進(jìn)而發(fā)生免疫因子大量表達(dá)的結(jié)果，比如圖４中蛋白條帶９的產(chǎn)生。

此外，研究表明ＬＰＳ可與肝組織受體ＴＬＲ４結(jié)合，激活下游信號(hào)ＮＦ－κＢ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和調(diào)控絲裂原激活蛋白激酶，使機(jī)體產(chǎn)生系列的免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷［９］。在病理學(xué)上，肝損傷應(yīng)視為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害的結(jié)果，其中由多種炎癥介質(zhì)相互作用參與并介導(dǎo)了肝細(xì)胞損傷的發(fā)生。從病理切片可以觀察到ＬＰＳ對動(dòng)物肝組織產(chǎn)生了明顯的病理損傷（圖２）。但是，靜脈注射ＬＰＳ引起肝臟損害的機(jī)制十分復(fù)雜，對肝臟與機(jī)體的影響，遠(yuǎn)不止內(nèi)毒素的直接作用，還與內(nèi)毒素激活肝臟Ｋｕｐｆｆｅｒ細(xì)胞產(chǎn)生與釋放的細(xì)胞因子與炎癥遞質(zhì)有關(guān)，這些物質(zhì)直接損傷肝細(xì)胞，導(dǎo)致微循環(huán)障礙，組織缺氧，自由基產(chǎn)生增多，進(jìn)一步損傷肝臟［１０］。所以，蛋白差異表達(dá)也可能是肝組織受到ＬＰＳ損傷的結(jié)果，而且白虎湯的治療作用可以緩解或改善ＬＰＳ引起的肝損傷，如圖４ Ｃ組中蛋白條帶５、６恢復(fù)了正常表達(dá)。

總之，１５ μｇ／ｋｇ劑量的ＬＰＳ能顯著引起動(dòng)物的發(fā)熱效應(yīng)，且對肝臟損傷及肝蛋白的表達(dá)變化有著直接影響。本研究提供的肝組織蛋白表達(dá)結(jié)果可以作為動(dòng)物溫病研究與評(píng)價(jià)的生物學(xué)指標(biāo)，為相關(guān)疾病的診療奠定了一定的基礎(chǔ)。

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