用RAPD標記研究苧麻屬植物的親緣關系

摘要：采用改良ＣＴＡＢ法提取了１３份苧麻屬材料的基因組ＤＮＡ，利用ＲＡＰＤ進行親緣關系分析。從１２０條隨機引物中篩選出了２３條引物，對１３份材料共擴增出２３５個條帶。根據(jù)擴增結(jié)果進行聚類分析，得到反映各材料間親緣關系的樹狀圖。ＲＡＰＤ的分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類學的分類結(jié)果基本相符。

關鍵詞：苧麻；親緣關系；ＲＡＰＤ

中圖分類號：Ｓ５６３．１；Ｑ７８文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1499-03

Genetic Relationship among Boehmeria spp. Revealed by RAPD

ＱＩＵ Ｃａｉ－ｓｈｅｎｇ，ＣＨＥＮＧ Ｃｈａｏ－ｈｕａ，ＺＨＡＯ Ｌｉ－ｎｉｎｇ，ＬＩ Ｙｕ－ｊｕｎ，ＺＡＮＧ Ｇｏｎｇ－ｇｕ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂａｓｔ Ｆｉｂｅｒ Ｃｒｏｐｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０２０５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｂｏｅｈｍｅｒｉａ ｓｐｐ． ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ １３ Ｂｏｅｈｍｅｒｉａ ｓｐｐ． ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）． ２３５ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ２３ ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ １２０ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｗｅｒｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ； ａｎｄ ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ ｓｈｏｗｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ． Ｔｈｉｓ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂｏｅｈｍｅｒｉａ spp.； ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ； ＲＡＰＤ

我國是苧麻的發(fā)源地，擁有最豐富的苧麻種質(zhì)資源。國內(nèi)的科技人員在苧麻資源的搜集、整理、評價方面做了大量工作。

在植物分類學方面，王文采［１］通過形態(tài)學分析對我國苧麻屬的３２種１１變種進行了比較全面的描述；臧鞏固［２］通過核型分析討論了苧麻屬五組間的進化關系。但是形態(tài)學分析和核型分析都有一定的局限性，隨著分子生物學的飛速發(fā)展，利用分子標記技術(shù)對植物進行更加準確客觀地分類鑒定和親緣關系分析成為可能。

本研究以栽培種苧麻“圓葉青”和其他１２份野生苧麻為試驗材料，利用ＲＡＰＤ技術(shù)分析它們之間的親緣關系，同時結(jié)合傳統(tǒng)分類學分類方法驗證其分析結(jié)果的可靠性，為分子標記技術(shù)在苧麻屬植物的鑒定分類及種間親緣關系上的分析應用提供了依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１３份苧麻材料見表１，均取自國家種質(zhì)長沙苧麻圃。

１．２方法

１．２．１基因組ＤＮＡ的提取與檢測ＤＮＡ提取采用改良ＣＴＡＢ法［３，４］并加以改進。取１３份苧麻屬材料的幼嫩葉片提取基因組ＤＮＡ。稀釋一定倍數(shù)后，應用紫外－可見分光光度計檢測其在２６０ ｎｍ和２８０ ｎｍ的吸光值，以測定ＤＮＡ濃度、評估其純度。

１．２．２ＲＡＰＤ反應體系的優(yōu)化參照鐘軍［５］、任春曉［６］的方法并對影響ＰＣＲ反應的各影響因子逐一進行梯度優(yōu)化，包括模板ＤＮＡ用量、Ｍｇ２＋濃度、Ｔａｑ酶用量、ｄＮＴＰｓ濃度、退火溫度、引物濃度、ＰＣＲ條件等，建立起適合本實驗的ＲＡＰＤ反應體系。

１．２．３ＲＡＰＤ擴增、電泳以提取的１３種基因組ＤＮＡ為模板，根據(jù)優(yōu)化后的ＲＡＰＤ反應體系，用１２０條ＲＡＰＤ引物分別進行ＰＣＲ擴增。ＰＣＲ產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度２％。ＥＢ染色后使用凝膠成像系統(tǒng)照相，觀察記錄。

１．２．４數(shù)據(jù)統(tǒng)計及遺傳多樣性分析選擇清晰且多態(tài)性較高的擴增條帶進行統(tǒng)計，相同位置有條帶的記為“１”，無條帶的記為“０”，失敗或缺失的記為“９”。基于擴增產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫，應用ＮＴＳＹＳｐｃ－２．１０ｅ軟件計算相似系數(shù)，以獲得１３份材料的遺傳相似系數(shù)矩陣，進而采用ＵＰＧＭＡ（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ａｖｅｒａｇｅｓ）法進行聚類分析，以獲得遺傳樹狀圖譜并進行分析。

２結(jié)果與分析

２．１基因組ＤＮＡ提取結(jié)果

野生苧麻的含糖量很高，從其中提取高質(zhì)量的基因組ＤＮＡ具有一定困難。通過改良的ＣＴＡＢ法從野生苧麻葉片中提取的基因組ＤＮＡ，經(jīng)紫外分光光度計測定，ＤＮＡ ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值為１．８～２．０，０．８％的瓊脂糖凝膠電泳顯示（圖１），所提取的基因組ＤＮＡ顯示為一條相對清晰完整的帶，大小在１９ ｋｂ左右，無明顯降解痕跡，也沒有可見的ＲＮＡ。說明本實驗所提取的苧麻基因組ＤＮＡ純度較高、質(zhì)量好，符合ＲＡＰＤ實驗要求。

２．２體系優(yōu)化結(jié)果

通過對各成分進行梯度實驗對比得到了較好的ＲＡＰＤ擴增體系和擴增條件，優(yōu)化后各成分最佳用量如表２，擴增程序為：９５℃變性５ ｍｉｎ；９４℃變性１．０ ｍｉｎ，３７．２℃退火１．０ ｍｉｎ，７２℃延伸１．５ ｍｉｎ，６個循環(huán)；９４℃變性４５ ｓ，３７．２℃退火４５ ｓ，７２℃延伸

１．５ ｍｉｎ，３８個循環(huán)；７２℃延伸１０ ｍｉｎ，最后４℃保存待電泳。

２．３ＲＡＰＤ擴增結(jié)果

用１２０條ＲＡＰＤ引物對１３個模板進行擴增，２．０％瓊脂糖電泳。其中２３條引物擴增得到了穩(wěn)定且多態(tài)性較好的ＲＡＰＤ圖譜，擴增效果如圖２；擴增出片段的分子量大多為０．３～３．０ ｋｂ；每個圖譜上，隨機引物擴增出的條帶數(shù)為８～１５條，共擴增出２３５個條帶。

２．４數(shù)據(jù)統(tǒng)計

２．４．１應用２３條引物對１３份材料進行遺傳相似性分析選取２３條引物擴增的產(chǎn)物電泳圖譜建立數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)分析，得到遺傳相似系數(shù)矩陣（表３）。從表中可以看出，遺傳相似系數(shù)為０．５２０～０．９５７，平均為０．６５９。其中懸鈴葉苧麻有性型與懸鈴葉苧麻無融合型二倍體的遺傳相似性最大，相似系數(shù)為０．９５７；倍性存在差異的兩個懸鈴葉苧麻無融合種，相似系數(shù)為０．８８１，反映了它們之間極為緊密的親緣關系。而圓葉青和大葉苧麻之間的遺傳距離最遠，相似系數(shù)最小為０．５２０，表明大葉苧麻在進化過程中可能處于最低的位置。

２．４．２聚類分析參照蔣彥波［７］的方法，利用相似系數(shù)矩陣，使用ＮＴＳＹＳ軟件ＵＰＧＭＡ方法對１３個基因型兩兩相似系數(shù)聚類分析生成樹狀圖譜，得到以下分析結(jié)果，材料被分為３個類群（圖３）。圓葉青和序葉苧麻各自獨立成一個類群；懸鈴葉苧麻無融合型二倍體、懸鈴葉苧麻有性型、懸鈴葉苧麻無融合型三倍體、大葉苧麻、小赤麻、赤苧、水苧麻、細野麻、柔毛苧麻、伏毛苧麻及長序苧麻被聚為第三類群。其中，懸鈴葉苧麻無融合型二倍體與懸鈴葉苧麻有性型親緣關系最近，與懸鈴葉苧麻無融合型三倍體的關系次之；再次為大葉苧麻；與其他種親緣關系則相對較遠。圓葉青屬于序栽培苧麻白葉種，栽培苧麻白葉種在傳統(tǒng)分類學上屬于苧麻組［8］；序葉苧麻在傳統(tǒng)分類學上屬于序葉苧麻組，其余的11份材料都屬于大葉苧麻組［1，8］；可見ＲＡＰＤ標記對苧麻屬１３份材料進行的聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類學基本一致；懸鈴葉苧麻３種不同的材料形態(tài)性狀近乎一致，傳統(tǒng)分類學方法通常難以鑒別，ＲＡＰＤ可以將三者明確區(qū)分開來，而且也明確將三者聚為一小組；大葉苧麻在外觀形態(tài)上最接近懸鈴葉苧麻，這也與利用ＲＡＰＤ標記做出的分類圖譜相一致；同時ＲＡＰＤ標記一一定位了各材料在樹狀圖譜中的位置，這些表明了ＲＡＰＤ分子標記用于分析苧麻屬內(nèi)種間親緣關系的可靠性和必要性。

３小結(jié)

傳統(tǒng)的親緣關系研究大多采用系譜、地理分布、形態(tài)及生化分析，這些分析雖然對闡明植物親緣關系起了很大的作用，但也有著相當?shù)木窒扌裕?］。苧麻屬的形態(tài)特征較為一致，種間形態(tài)學分類所依據(jù)的結(jié)構(gòu)特征相似，差別細微，加上本屬植物生長范圍極廣，受環(huán)境影響導致變異的較多，因此，對其進行分類鑒定及親緣關系的研究顯得較為困難。本研究通過ＲＡＰＤ分析確立了苧麻屬１３份材料之間的親緣關系，并根據(jù)傳統(tǒng)分類學與形態(tài)分類學對照分析證明了ＲＡＰＤ確定的親緣關系的可靠性；這不僅可以推動苧麻屬植物分類學的深入發(fā)展，而且會更加客觀準確地反映生物種的特征和種間的親緣關系。

參考文獻：

［１］ 王文采．中國苧麻屬校訂［Ｊ］．云南植物研究，１９８１，３（３）：３０７－３２８．

［２］ 臧鞏固． 苧麻屬三組五種核型研究［Ｊ］． 中國麻業(yè)，１９９３（１）：１－６．

［３］ 宋國立，崔榮霞， 王坤波， 等． 改良ＣＴＡＢ法快速提取棉花ＤＮＡ［Ｊ］． 棉花學報，１９９８，１０（５）：２７３－２７５．

［４］ 李榮華，夏巖石， 劉順枝，等． 改進的ＣＴＡＢ提取植物ＤＮＡ方法［Ｊ］． 實驗室研究與探索，２００９，２８（９）：１４－１６．

［５］ 鐘軍，李栒，官春云，等．中國蕓芥栽培品種親緣關系的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］． 中國農(nóng)業(yè)科學，２００４，３７（１０）：１４３４－１４３８．

［６］ 任春曉，劉敏，鹿金穎，等． 空間誘變育成的茄子“ＨＡＮＧＱＩＥ－５”的ＲＡＰＤ體系優(yōu)化及ＲＡＰＤ分析［Ｊ］． 航天醫(yī)學與醫(yī)學工程，２０１０，２３（１）：５２－５６．

［７］ 蔣彥波． 苧麻微衛(wèi)星的分離與鑒定及其在苧麻組親緣關系研究中的應用［Ｍ］． 北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，２００５．

［８］ 張波，鄭長清，臧鞏固． 中國苧麻屬組群分類及演化研究［Ｊ］． 作物學報，１９９８，２４（６）：７７５－７８１．

［9］ 揭雨成，周青文， 陳佩度． 苧麻栽培品種親緣關系的ＲＡＰＤ分析［Ｊ］． 作物學報，２００２，２８（２）：２５４－２５９．