擬南芥抗日本曲霉毒素SAF突變體的篩選

摘要：黑麥酮酸Ｆ（ＳＡＦ）是從日本曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）中分離的化感物質(zhì)。以擬南芥為材料， 在萌發(fā)期和幼苗期分別以０．２50、０．３00 ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ為選擇濃度， 根據(jù)種子是否萌發(fā)和幼苗能否存活為指標，并結(jié)合細胞死亡、ＭＤＡ含量、Ｈ２Ｏ２含量等植物生理生化指標初步篩選得到擬南芥抗ＳＡＦ突變體Ｈｓｔ １，為進一步研究ＳＡＦ的化感作用機理提供試驗材料，也為擬南芥突變體的快速篩選技術(shù)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：擬南芥； 黑麥酮酸Ｆ； 突變體

中圖分類號：Ｓ３３５；Ｑ９４９．７４８．３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）07－1480-04

Screening of Arabidopsis thaliana Resistant Mutants against Aspergillus japonicus Toxin SAF Using Physiological and Biochemical Methods

ＬＩ Ｍｉｎｇ１，ＺＥＮＧ Ｒｅｎ－ｓｅｎ２，ＬＵＯ Ｓｈｉ－ｍｉｎｇ２

（１．Ｇｕａｎｇdｏｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０００６，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｅｃａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ Ｆ（ＳＡＦ） waｓ ａｎ ａｌｌｅｌｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ． Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ， ０．２5 ｍmol/L ａｎｄ ０．３ ｍmol/L ＳＡＦ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｔ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ａｎｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ， ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｅｘｅｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｒａｔｅ， ＭＤＡ ｃｏｎｔｅｎｔ，Ｈ２Ｏ２ ｃｏｎｔｅｎｔ， Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔｓ Hｓｔ １ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＳＡＦ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｐｒｉｍａｒｉｌｙ． Ｔｈｉｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｗould ｐｒｏｖｉｄｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｌｌｅｌｏｐａｔｈｙ ｏｆ ＳＡＦ， ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｏｍｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｍｕｔａｎｔｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Aｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎ； ｓｅｃａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ Ｆ； ｍｕｔａｎｔ

黑麥酮酸Ｆ（Ｓｅｃａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ Ｆ，簡稱ＳＡＦ）是從日本曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中提取的毒素［１］，研究表明，ＳＡＦ對多種植物具有顯著的化感作用［２］，是一種寄主非選擇性毒素，對于這類毒素化感作用的機制研究具有一定的普遍意義。為了深入研究ＳＡＦ對受體植物的作用機理，我們進行了擬南芥ＳＡＦ耐性突變體的篩選試驗。目前已從擬南芥中分離得到了幾千種突變體，在植物研究的突破性進展中扮演著重要的角色［３］，而利用擬南芥突變體進行植物化感方面的研究還少見報道。此項研究將為進一步揭示ＳＡＦ對植物的化感作用機制，以及探索研究植物化感作用的新思路提供依據(jù)。

１材料與方法

１．１試驗材料

１．１．１擬南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）生態(tài)型Ｃｏｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）種子萌發(fā)期篩選用濾紙，每皿放兩張；苗期篩選播種于裝有１／２ Ｈｏａｇｌａｎｄ營養(yǎng)液蛭石的塑料小杯中，上面覆蓋塑料薄膜并扎小孔。播種后于暗處以４℃低溫處理４８ ｈ，將培養(yǎng)杯置于ＦＭ－５ＸＸ智能型人工氣候箱中，生長條件為２2℃、１２０ μｍｏｌ／（ｍ２·ｓ）、１６ ｈ／８ ｈ（光／暗），濕度為８０％。４ ｄ后全部出苗，揭去塑料膜，及時補充水分或營養(yǎng)液。

１．１．２ＳＡＦ毒素來源于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶亞熱帶植物生態(tài)研究所。

１．２試驗方法

１．２．１篩選試驗一般來說，篩選突變體均以在一定的篩選條件下，突變體植株與正常型植株在某一性狀上呈現(xiàn)明顯差異時，確定其為已突變的突變體［４］。參照我們前期工作的方法［２］處理擬南芥，觀察植株對ＳＡＦ敏感程度不同而表現(xiàn)出的表型差異確定。測定其根、植株生長情況、黃葉率、存活率等生理生化指標。

１．２．２Ｈ２Ｏ２含量的測定取擬南芥幼苗葉片０．５ ｇ，加入預(yù)冷的３％的三氯乙酸（ＴＣＡ）研磨，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，取上清液１ ｍＬ，加入等體積的１０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸緩沖液（ｐＨ＝７．０）和２ ｍＬ １ ｍｏｌ／Ｌ的ＫＩ，搖勻，３９０ｎｍ測吸光值，結(jié)果以μｇ／ｇＦＷ表示，用溶于３％的三氯乙酸的Ｈ２Ｏ２（５０～２００ μｇ／ｍＬ）作標準曲線。

１．２．３ＤＮＡ的提取和檢測取擬南芥幼苗葉片０．１ ｇ，用ＣＴＡＢ法抽提總ＤＮＡ，１．２％的瓊脂糖凝膠分離，ＥＢ染色，１２０V恒壓電泳１ ｈ，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀測，拍照。

１．２．４電導(dǎo)率測定剪取擬南芥葉片用去離子水沖洗約３ ｍｉｎ，浮在去離子水中３ ｈ，以ＤＤＳ－１１Ａ型電導(dǎo)率儀測定溶液的電導(dǎo)率。

２結(jié)果與分析

２．１萌發(fā)期篩選條件的確立

首先對ＳＡＦ處理的擬南芥Ｃｏl種子萌發(fā)狀況進行了觀察，發(fā)現(xiàn)擬南芥Ｃｏｌ播種在不含ＳＡＦ的培養(yǎng)基質(zhì)中，４ ｄ后萌發(fā)率為１００％，隨著ＳＡＦ濃度的升高，萌發(fā)率逐漸降低，當(dāng)ＳＡＦ濃度為０．０７５ ｍｍｏｌ／Ｌ時，萌發(fā)率降至５２％；ＳＡＦ濃度為０．２５０ ｍｍｏｌ／Ｌ時，萌發(fā)率為０（圖１）。因此，以０．２５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ下種子是否萌發(fā)為指標，進行篩選。

２．２苗期篩選條件的確立及突變體的篩選

將擬南芥生態(tài)型Ｃｏl種子播種在培養(yǎng)基質(zhì)中，在正常的培養(yǎng)基質(zhì)上生長７ ｄ后移至添加不同濃度ＳＡＦ的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，定時觀察擬南芥苗的存活率，確定SAF選用的濃度和時間。結(jié)果，在０．３００ ｍｍｏｌ／Ｌ中處理４ ｄ后的擬南芥生態(tài)型Ｃｏｌ苗黃化死亡，其存活率為０。據(jù)此，我們即用０．３００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ作為野生型擬南芥可以生長的最高濃度。經(jīng)過２０ ｄ的培養(yǎng)篩選，篩選到７株對ＳＡＦ不敏感的突變體，有一株長勢及生物學(xué)性狀明顯優(yōu)于其他株，因而將其定為耐０．３00 ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ突變體（Ｈｓｔ １）。

２．３擬南芥Col與Ｈｓｔ １的生物學(xué)性狀比較

將擬南芥Col與Ｈｓｔ １ Ｍ１代種子分別播種于混有滅菌的營養(yǎng)土（營養(yǎng)土∶蛭石＝２∶１，Ｖ／Ｖ）中，在２２℃、光照強度１２０ μｍｏｌ／（ｍ２·ｓ）、光暗周期１６ ｈ／８ｈ，濕度為８０％的條件下培養(yǎng)，觀測其在不同生長期（第２５天和第４５天）的生物學(xué)性狀，結(jié)果見表１、圖２和圖３。生長２５ ｄ和４５ ｄ的擬南芥Col及Ｈｓｔ１幼苗在生物學(xué)性狀上呈現(xiàn)差異，兩個生長期Ｈｓｔ１的蓮座葉片數(shù)、蓮座葉長和蓮座葉寬都高于Col的相應(yīng)指標。

２．４ＳＡＦ處理對生態(tài)型Ｃｏｌ及Ｈｓｔ １幼苗生長的影響

不同濃度的ＳＡＦ處理２４ ｈ，測定１４ ｄ齡的生態(tài)型Col和Hｓｔ１ Ｍ１代幼苗生長的影響，結(jié)果顯示，ＳＡＦ對生態(tài)型Col和Ｈｓｔ１幼苗的生長影響有差異，隨ＳＡＦ濃度的升高，二者的蓮座葉片數(shù)、蓮座葉長、蓮座葉寬以及株高都有減少的變化，以０．１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ和０．３００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ處理的幼苗比較，生態(tài)型Col蓮座葉長的降幅分別為４５．５％和４６．０％，Ｈｓｔ １的下降幅度分別為１７．５％和18．４％；生態(tài)型Col的株高分別下降了２５．２％和２９．５％，Ｈｓｔ １分別下降了１．２％和２．１％（表２）。

２．５ＳＡＦ處理對生態(tài)型Col及其突變體幼苗葉片的電導(dǎo)率的影響

葉片的電導(dǎo)率表示葉片離子滲漏的程度，也是反映細胞死亡程度的指標之一［５］。試驗結(jié)果顯示，在０．３００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ處理下，隨處理時間的延長，生態(tài)型Col和Hｓｔ １的幼苗葉片的電導(dǎo)率都有升高的變化，在處理７２ ｈ和９６ ｈ時，生態(tài)型Col的電導(dǎo)率分別升高了５８．５％和６５．１％，與對照相比，差異顯著；Hｓｔ １的分別增加了６．７％和７．２％，與對照相比，無顯著差異（圖４）。

２．６ＳＡＦ處理對擬南芥生態(tài)型Col與Ｈｓｔ １ Ｍ１幼苗葉片的ＤＮＡ電泳檢測比較

研究表明，許多化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的細胞凋亡與化學(xué)物質(zhì)的濃度有關(guān)，濃度過高會導(dǎo)致細胞壞死，這種現(xiàn)象稱劑量效應(yīng)。壞死與凋亡的典型區(qū)別是壞死是一種被動的死亡程序，它不是一種生理過程，其典型的生化標志是ＤＮＡ出現(xiàn)隨機降解，常規(guī)瓊脂糖電泳檢測不出條帶，只能見到拖帶或隨機片段現(xiàn)象［６］。研究顯示，０．３００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ處理４８ ｈ的生態(tài)型Col與Ｈｓｔ １的擬南芥葉片ＤＮＡ電泳圖譜顯示，生態(tài)型Col的在１５０ ｂｐ左右處有一ＤＮＡ片段，表明０．３００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ處理的生態(tài)型Col擬南芥葉片出現(xiàn)壞死現(xiàn)象。

２．7ＳＡＦ處理對擬南芥生態(tài)型Col與Ｈｓｔ １葉片的Ｈ２Ｏ２含量比較

ＳＡＦ處理對擬南芥生態(tài)型Col與Ｈｓｔ １葉片的Ｈ２Ｏ２含量影響結(jié)果見圖６。０．３００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ處理的擬南芥生態(tài)型Col與Ｈｓｔ １在測試時間內(nèi)葉片的Ｈ２Ｏ２含量都呈升高的變化，在處理７２ ｈ和９６ ｈ，野生型與Ｈｓｔ １均有升高的變化，野生型Ｈ２Ｏ２含量較對照升高了２５．６％和３６．５％，與對照比較，差異極顯著（Ｐ＜０．０１），Hｓｔ １的Ｈ２Ｏ２含量分別增加了６．１％和５．７％，與對照比較，沒有顯著差異。

３討論

ＳＡＦ是一種寄主非選擇性真菌毒素，研究這類毒素與植物之間的關(guān)系具有一定的普遍意義，以往的一些研究證實了ＳＡＦ對許多高等植物具有化感作用［１，２，６］。該研究通過生測指標、ＤＮＡ、電導(dǎo)率及Ｈ２Ｏ２等生理生化指標，初步篩選到擬南芥抗ＳＡＦ突變體Hｓｔ １。

許多真菌毒素可以引起受體細胞死亡［７］。研究表明，０．３００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ處理擬南芥生態(tài)型Col根部，在１５０ ｂｐ左右處有一ＤＮＡ片段，表明０．３00 ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ處理對擬南芥生態(tài)型Col幼苗葉片產(chǎn)生了細胞壞死的影響。植物細胞死亡的產(chǎn)生或調(diào)控機制與活性氧（ＲＯＳ）有關(guān)，特別與Ｈ２Ｏ２的含量有關(guān)，Ｈ２Ｏ２不僅對細胞有一定毒性，也是細胞死亡的一種重要信號分子［８］。研究表明，０．３00 ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＡＦ處理７２ ｈ后，擬南芥生態(tài)型Col的Ｈ２Ｏ２含量顯著增加。

ＭＤＡ是膜質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，具有很強的細胞毒性，ＭＤＡ含量高低是反映細胞膜質(zhì)過氧化作用強弱的重要指標［９］。Ｈ２Ｏ２等活性氧分子是導(dǎo)致ＭＡＤ含量升高的重要因素，可以推測，ＳＡＦ導(dǎo)致了Ｈ２Ｏ２等活性氧含量的升高，進而引起了細胞死亡及ＭＤＡ的升高。生物學(xué)性狀是檢測突變體的一個很重要的指標，有許多突變體的生物學(xué)性狀發(fā)生了一定的變化。擬南芥抗ＳＡＦ突變體Hｓｔ １的生物學(xué)性狀較生態(tài)型Col的有一定的差異，從形態(tài)上可以將生態(tài)型Col與Hｓｔ １區(qū)別開來。研究以植物生理生化的方法，篩選得到擬南芥抗ＳＡＦ突變體Hｓｔ １，為進一步研究ＳＡＦ的化感作用機理提供了直接的試驗材料，也為擬南芥突變體的快速篩選技術(shù)提供了參考依據(jù)。

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