野生馬齒莧草粉總黃酮的提取及含量測定

摘要：采用單因素試驗和正交試驗設(shè)計，利用乙醇溶劑浸提結(jié)合超聲波輔助提取法對盛花期野生馬齒莧草粉中總黃酮的優(yōu)化提取工藝進行了研究，并用分光光度計比色法對提取的總黃酮含量進行了檢測。試驗結(jié)果表明，野生馬齒莧草粉中總黃酮的優(yōu)化提取條件為，乙醇濃度為７０％，提取時間為３０ ｍｉｎ，提取溫度為７０℃，料液比為１∶３０（ｍ∶Ｖ，ｇ∶ｍＬ），得到野生馬齒莧草粉中總黃酮含量為５．２８１ ７％。

關(guān)鍵詞：馬齒莧；總黃酮；超聲波；乙醇浸提

中圖分類號：Q949.745.6文獻標識碼：A文章編號：0439－８114（２０11）07－1462-03

Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｗｉｌｄ Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｍｅａｌ

ＨＵＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｈｏｎｇ，ＹＩＮ Ｗｕ－ｐｉｎｇ，ＨＡＯ Ｘｉａｏ－ｈｕａ

（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｈｕｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｔｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈａｎｇｄｅ ４１５０００，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｗｉｌｄ Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｍｅａｌ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗａｓ ７０％ ｅｔｈａｎｏｌ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ， ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ａｔ １∶３０（ｍ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ）， ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｔ ７０℃． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ ｗｉｌｄ Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｍｅａｌ ｗａｓ ５．２８１ ７％ ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｏｒｔｕｌａｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ； ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

馬齒莧是馬齒莧科一年生草本植物，也是一種菜藥兩用的植物，其分布十分廣泛。據(jù)報道，每

１００ ｇ馬齒莧鮮莖葉中約含水分９０．３0 ｇ、蛋白質(zhì)２．３0 ｇ、脂肪０．５７ ｇ、碳水化合物２．４３ ｇ、粗纖維

２．３８ ｇ、灰分２．０２ ｇ以及多種維生素［１，２］。這就證實了馬齒莧具有較高的營養(yǎng)功能和飼用價值，不僅可以作為人的食物，在動物飼料資源開發(fā)利用方面也具有很大潛力。現(xiàn)代研究證實，馬齒莧除含有多種營養(yǎng)成分外，還含有一定量的生物堿、黃酮類化合物、強心甙、蒽醌類化合物、蘋果酸、檸檬酸、皂甙、鞣質(zhì)等活性成分。黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的一大類多酚類化合物，多以甙類形式存在，有關(guān)黃酮的藥理作用的研究報道較多，如黃酮的抗氧化作用和免疫調(diào)節(jié)等方面的研究。為了探討馬齒莧草粉在動物飼料中的應(yīng)用前景，尤其是在防止飼料脂質(zhì)過氧化以及提高動物免疫力等方面的價值，對盛花期野生馬齒莧草粉中的總黃酮的提取工藝進行了研究，并對總黃酮的含量進行了測定。

１材料與方法

１．１試驗材料

１．１．１試驗樣品開花期野生馬齒莧于２００９年８月采自湖南省常德市周邊。將去根、去雜質(zhì)后的新鮮馬齒莧于６５℃烘至恒重，粉碎后過４０目篩，制成分析樣，于密封樣品袋中保存，待測。

１．１．２藥品與試劑蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所）、石油醚、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，以上藥品與試劑均為分析純。

１．１．３儀器設(shè)備超聲波提取器（ＫＱ２２５０Ａ型）、紫外可見分光光度計（ＵＶ－７２００型）、精密電子天平（ＢＳ－１２４，精密度０．０００ １ g）、恒溫水浴鍋（ＴＤＡ－８００２型）、干燥箱（ＪＫ－Ｈ１０１－２Ａ）、索式提取器。

１．２試驗方法

１．２．１試驗設(shè)計采用單因素試驗設(shè)計分別研究4個因素，即乙醇濃度、提取時間、料液比和提取溫度對馬齒莧總黃酮提取量的影響。具體研究方案為不同乙醇濃度（體積分數(shù)４０％、５０％、６０％、７０％、８０％），最佳乙醇濃度＋超聲波提取時間（２０、２５、３０、３５、４０ｍｉｎ），最佳乙醇濃度＋最佳超聲波提取時間＋料液比（１∶２０、１∶３０、１∶４０、１∶５０，ｍ∶Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同），最佳乙醇濃度＋最佳超聲波提取時間＋最佳料液比＋提取溫度（５０、６０、７０、８０、９０℃）。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交選擇試驗將料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間共四因素各三水平，選用Ｌ９（３４）正交表對馬齒莧總黃酮的最佳提取條件及提取量進行研究。

１．２．２總黃酮的提取方法稱取待測樣品→索氏提取法脫脂→精密稱取１ ｇ脫脂樣品于５０ ｍＬ錐形瓶中→加入一定體積的乙醇溶液→超聲波輔助提取兼水浴加熱提取一定時間→趁熱過濾→用相應(yīng)體積濃度的乙醇定容至１００ ｍＬ，搖勻，制得馬齒莧總黃酮提取液，待測。

１．２．３蘆丁標準曲線的繪制精密稱取蘆丁對照品５０ ｍｇ，用體積分數(shù)７０％的乙醇溶解，定容至

５０ ｍＬ容量瓶中搖勻。得到１ ｍｇ／ｍＬ蘆丁標準貯備液。精密移取１ ｍｇ／ｍＬ蘆丁標準貯備液８ ｍＬ于１０ ｍＬ容量瓶中，用去離子水定容，得到０．８ ｍｇ／ｍＬ蘆丁標準溶液。精密吸取０．８ ｍｇ／ｍＬ蘆丁標準溶液０．０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍＬ，分別置于１０ ｍＬ容量瓶中，加質(zhì)量分數(shù)５％的ＮａＮＯ２ ０．４ ｍＬ，放置６ ｍｉｎ后，加質(zhì)量分數(shù)１０％的Ａｌ（ＮＯ３）３ ０．４ ｍＬ，放置６ ｍｉｎ，再加質(zhì)量分數(shù)４％的ＮａＯＨ ４．０ ｍＬ，加去離子水至刻度，搖勻，放置１５ ｍｉｎ，進行全波長掃描，在５１０ｎｍ處有最大吸收波長，測定吸光度，并以蘆丁溶液濃度（Ｃ）為橫坐標，吸光度（Ａ）為縱坐標，制作標準曲線（圖１）。

１．２．４樣品總黃酮含量的測定精密吸取總黃酮提取液１．０ ｍＬ置于１０ ｍＬ容量瓶中，加去離子水至２．４ ｍＬ，加入５％的ＮａＮＯ２ ０．４ ｍＬ，搖勻，放置６ ｍｉｎ；加入１０％的Ａｌ（ＮＯ３）３ ０．４ ｍＬ，搖勻，放置６ ｍｉｎ；加入４％的ＮａＯＨ ４．０ ｍＬ，再加去離子水至刻度，搖勻，放置１５ ｍｉｎ。以試劑空白為參比，用紫外可見分光光度計，在５１０ ｎｍ波長處測定吸光度，將吸光度（ｙ）代入標準曲線方程，計算得總黃酮含量（ｘ）。

２結(jié)果與分析

２．１單因素試驗及分析

２．１．１乙醇濃度對總黃酮提取量的影響分別用４０％、５０％、６０％、７０％、８０％的乙醇提取馬齒莧草粉中總黃酮，總黃酮提取量隨著乙醇濃度的增加呈先增加后減少的趨勢（圖２）。乙醇濃度在６０％時總黃酮提取量最大，乙醇濃度超過６０％時提取量有所減少，但是７０％乙醇溶液提取得到的總黃酮量僅比６０％乙醇溶液的提取量低０．０７％。結(jié)果表明提取馬齒莧草粉總黃酮的最佳乙醇濃度應(yīng)為６０％。

２．１．２提取時間對提取效果的影響采用６０％乙醇溶液結(jié)合超聲波輔助提取馬齒莧中總黃酮，分別將提取時間設(shè)為２０、２５、３０、３５、４０ ｍｉｎ，發(fā)現(xiàn)總黃酮提取量隨著提取時間的變化而變化（圖３）。超聲波輔助提取時間為３０ ｍｉｎ時，總黃酮的提取量最大。表明總黃酮的最佳提取時間為３０ ｍｉｎ。

２．１．３料液比對提取效果的影響設(shè)置４種不同料液比（１∶２０、１∶３０、１∶４０、１∶５０），采用６０％乙醇溶液和超聲波輔助提取３０ ｍｉｎ。結(jié)果表明（圖4），當料液比為１∶３０時，總黃酮的提取量最大，料液比小于

１∶３０時，總黃酮提取量反而下降。這可能是增大提取劑體積到一定程度會增加總黃酮的稀釋倍數(shù)，反而不利于總黃酮含量測定。故提取馬齒莧草粉中總黃酮的適宜料液比應(yīng)為１∶３０。

２．１．４提取溫度對提取效果的影響采用６０％的乙醇溶液，按１∶３０的料液比，分別于５０、６０、７０、８０和９０℃條件下，超聲波輔助提取馬齒莧草粉３０ｍｉｎ。當提取溫度從５０℃上升到９０℃的過程中，總黃酮的提取量先隨溫度的增加而增加，后隨溫度的增加而減少（圖5）。在７０℃時，總黃酮提取量有最大值，這表明馬齒莧草粉總黃酮提取溫度以７０℃為宜。

２．２正交試驗及分析

將乙醇濃度、提取時間、料液比、提取溫度這４個影響總黃酮提取量的因素按四因素三水平進行正交試驗（表１、２）。正交試驗的直觀分析結(jié)果表明，４個因素對提取效果影響與前面單因素的試驗結(jié)果相同，各因素水平之間的極差大小依次為Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ，表明對總黃酮提取效果影響由大到小依次是乙醇濃度＞提取溫度＞料液比＞提取時間。由正交試驗得最佳提取條件為Ａ３Ｂ３Ｃ１Ｄ２，即乙醇濃度為７０％，提取時間為３０ ｍｉｎ，料液比為１∶３０，提取溫度為７０℃。正交試驗得出的馬齒莧總黃酮最優(yōu)提取條件基本符合單因素試驗結(jié)果，雖然乙醇濃度有所變化，但單因素試驗結(jié)果中表明用６０％的乙醇溶液和用７０％乙醇溶液提取得到的總黃酮含量非常接近。本試驗得出的馬齒莧草粉總黃酮最佳提取條件中提取時間與孫希云等［３］的結(jié)果相同，乙醇濃度與伊長文等［４］的結(jié)果一致。

２．３驗證試驗及分析

精確稱取４份１．０００ ０ ｇ脫脂馬齒莧草粉，加入３０ ｍＬ的７０％的乙醇溶液于７０℃條件下超聲波輔助提取３０ ｍｉｎ，過濾，定容至１００ ｍＬ，分別制得４份總黃酮提取液。按前述方法于分光光度計上測定吸光度。根據(jù)標準曲線方程和稀釋倍數(shù)計算得到總黃酮平均提取量為５．２８１ ７%±０．００６ ７%（風(fēng)干基礎(chǔ)）。該測定值高于正交試驗中的任一組值，且４個平行測定值比較接近，表明試驗得出的最優(yōu)提取條件是有效的。

據(jù)報道，滕茶總黃酮提取量為１６．５１０ ０％［5］，葛根總黃酮提取量為６．４０５ １％［6］，蜈蚣草總黃酮提取量為６．１５０ ０％［7］，苦蕎總黃酮提取量為２．６９６ ９％［8］。野生馬齒莧草粉中總黃酮含量雖低于滕茶、葛根和蜈蚣草，但高于苦蕎。

３結(jié)論

１）正交試驗結(jié)果表明乙醇濃度、提取時間、料液比以及提取溫度均會影響總黃酮提取量，其中乙醇濃度對試驗結(jié)果影響最大，其次是提取溫度，再次是料液比，影響最小的是提取時間。超聲波輔助提取野生脫脂馬齒莧草粉總黃酮的最佳工藝條件為，乙醇濃度為７０％，提取溫度為７０℃，提取時間為３０ ｍｉｎ，料液比為１∶３０。在此條件下，馬齒莧草粉總黃酮提取量為５．２８１ ７％。

２）野生馬齒莧草粉中總黃酮的含量高于苦蕎，與蜈蚣草相差不大。因此，將野生馬齒莧草粉添加到動物飼料中，預(yù)計對飼料的保存以及提高動物免疫力方面能夠起到一定作用，但作用效果如何還有待通過動物試驗進行深入研究。

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