小麥抗條銹病基因Yr5分子標記檢測

摘要：為給小麥新品系的抗性遺傳基礎鑒定及持久抗性新品種選育提供技術支撐，以２２個小麥條銹病抗性品種、２個感病品種及１２個野生近緣物種為材料，采用ＰＣＲ方法探討了小麥條銹病的抗性基因分子標記Ｙｒ５－１５６在這些材料中的分布。結果表明，在多數抗病材料中能擴增出抗病基因Ｙｒ５分子標記特異性條帶；但在２個感病材料中也擴增出來了同樣的特異性條帶。表明抗條銹病基因Ｙｒ５的分子標記Ｙｒ５－１５６不能作為分子標記輔助育種手段直接應用，需對其做進一步的驗證。

關鍵詞：小麥；抗條銹病基因Ｙｒ５；分子標記

中圖分類號：Ｓ５１２．１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1901-03

Detection of Molecular Marker Linking to Wheat Stripe Rust-resistance Gene Yr5

ＺＨＡＮＧ Ｓｈｅｎｇ－ｌｉ，ＺＨＯＵ Ｙａｎ，ＺＨＡＯ Ｊｕｎ－ｊｉｅ，ＲＵ Ｚｈｅｎ－ｇａｎｇ

（Ｋｅｙ Ｄｉｓｃｉｐｌｉｎｅ Ｏｐｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｎ Ｃｒｏｐ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｌｅａｒｎｉｎｇ／Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｆｆｅｒ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｎｅｗ wheat ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｎｅｗ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ， ２２ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， ２ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ａｎｄ １２ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｌｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ （Ｙｒ５－１５６） ｌｉｎｋｉｎｇ ｔｏ ｗｈｅａｔ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ-ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ Ｙｒ５ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｎｄｓ ｏｆ Ｙｒ５－１５６ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｍｏｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ materials ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｙｒ５－１５６ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ， ａｎｄ ｎｅｅｄ to be ｆｕｒｔｈｅｒ verificated．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｅａｔ； ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ－ｒｅｓｉｓｔａｎt ｇｅｎｅ Ｙｒ５； ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ

小麥條銹病是由小麥條銹菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ ｆ． ｓｐ． ｔｒｉｔｉｃｉ）引起的一種世界范圍的嚴重病害，也是我國發生范圍最廣、危害程度最重的小麥病害之一。選育抗病品種是防治小麥條銹病最經濟、有效和環保的舉措［１，２］。由于新的條銹菌生理小種的產生，特別是強毒性小種條中３２（ＣＹＲ３２）、３３（ＣＹＲ３３）出現以后，絕大部分抗條銹病基因在我國已經喪失了抗性，從而導致２００２年條銹病大流行。現有的條銹病抗源中只有Ｙｒ５、Ｙｒ１０、Ｙｒ１５、Ｙｒ２４、Ｙｒ２６等少數基因還保持著對ＣＹＲ３２、ＣＹＲ３３的抗性［３，４］。因此，發掘新的抗病基因及與其緊密連鎖的分子標記、培育抗病基因聚合品種和多系品種，對條銹病的持久防治具有重要意義［５－７］。

本研究以２２個抗性、２個感病小麥品種（表１）及１２個小麥野生近緣物種（表２）為實驗材料，通過ＰＣＲ擴增來檢測Ｙｒ５基因分子標記Ｙｒ５－１５６［8］在這些材料中的分布，可為不同抗源材料的抗性遺傳基礎鑒定及新抗源材料的篩選提供理論支持，對加快小麥新抗病品種培育及提高抗病品種的抗性持久性有重要意義。

１材料與方法

１．１材料

本研究所用的植物材料見表１和表２。

１．２方法

ＤＮＡ提取主要采用ＣＴＡＢ法［9，10］。

用已經報道的抗條銹病基因Ｙｒ５的分子標記Ｙｒ５－１５６［8］對上述２２個抗性品種、２個感病品種和１２個野生近緣物種進行ＰＣＲ擴增，引物序列為Ｙｒ５－１５６Ｓ：５′－ＣＡＡＴＡＧＴＴＡＧＧＣＡＡＡＴＴＡＣＡＴＣＧ－３′；Ｙｒ５－１５６Ａ：５′－ＴＧＣＡＡＡＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡ

－３′。

采用２０ μＬ反應體系：上下游引物各１．０ μＬ、１０ μｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２．０ μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２．０ μＬ、２．５ Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ １１．５ μＬ、１０ ｎｇ／μＬ 模板ＤＮＡ ２．０ μＬ。ＰＣＲ循環反應程序：９４ ℃、３ ｍｉｎ；９４ ℃、１ ｍｉｎ，６０ ℃、１ ｍｉｎ，７２ ℃、１ ｍｉｎ，３５個循環；７２ ℃、５ ｍｉｎ。采用２％瓊脂糖凝膠進行電泳，然后用凝膠成像系統進行觀察照相。

２結果分析

Ｙｒ５基因的特異引物Ｙｒ５－１５６擴增的目標帶大小是１５６ ｂｐ左右［8］，圖１、２表明，多數材料中都能夠擴增出特異片段，同時從擴增結果中不難看出各泳道均有引物二聚體出現。９號（ＣＰ０２－９－２－２－１）、１４號（內２８３６）是２個抗性較好的材料，但沒有擴增出Ｙｒ５－１５６的特異性條帶，說明這２個材料里面可能不含有Ｙｒ５基因或與其連鎖的分子標記，而含有其他的抗病基因，也可能這２個材料中含有Ｙｒ５基因但由于這個標記與抗病基因Ｙｒ５遺傳距離較大發生交換所致。而２３號（山農０１５１８９）和２４號（連０３６６）２個感病材料卻擴增出了目標條帶，這２個材料中可能含有Ｙｒ５基因或與其緊密連鎖的分子標記，但Ｙｒ５基因是抗性較好的小麥抗條銹病主效基因，目前，在我國還未發現能克服它的生理小種［１１］。感病材料中檢測到了Ｙｒ５－１５６，可能與這個標記與抗病基因Ｙｒ５遺傳距離較大發生交換而導致標記存在但抗病基因實際上不存在；也可能是這２個材料雖然含有Ｙｒ５基因的特異引物Ｙｒ５－１５６序列相似區，但該ＤＮＡ區段所含有的Ｙｒ５基因已經突變為不抗病或者材料繁殖過程中由于混雜發生交換而丟失。

圖３表明，在１２個野生近緣材料中有J9（斯卑爾托小麥）、J10（提莫菲維小麥）、J11（節節麥）、J12（波斯小麥ＰＳＳ）４個材料擴增出目標大小的條帶，同時在這１２個材料擴增結果中也不同程度地出現了引物二聚體。這４個材料擴增出了目標條帶，說明這４個材料中可能含有Ｙｒ５或與其緊密連鎖的分子標記，但除Ｊ１２（波斯小麥ＰＳＳ）外，擴增條帶都比較弱，其中Ｊ９（斯卑爾托小麥）是該基因來源物種，這可能是因為篩選分子標記Ｙｒ５－１５６時所用的遺傳群體在來自斯卑爾托小麥的含Ｙｒ５基因的ＤＮＡ片段上與分子標記Ｙｒ５－１５６的引物結合區序列發生了一定變異，導致擴增效果不理想。

３討論

多年來廣大農業科研工作者已經開發出了許多條銹病抗病基因的分子標記，但這些標記能不能直接被用于抗病材料的遺傳鑒定進而進行標記輔助育種還有待研究。本研究證明分子標記Ｙｒ５－１５６在抗病、感病材料中均出現，所以還不能直接應用于抗病基因Ｙｒ５的分子標記輔助育種。陳曉紅［8］開發的這個標記與抗病基因Ｙｒ５的交換率為０的數據來自于對Ｆ２代分離群體１２１個單株的檢測結果，這個群體量太小，連鎖值可能有較大的偏差。由于遺傳距離與小麥材料的遺傳背景有一定關系，文獻中的結論可能只適于其所研究的群體。對于分子輔助育種來說，如果想繼續利用這個分子標記，還需要繼續深入的探討。

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