棉花黑斑病病原鑒定及生防木霉菌株的篩選

摘要：從河南省部分地區感染黑斑病的棉花葉片上分離病原菌，并對其致病力、病原及其生防木霉菌株進行了研究。共分離到５株棉花黑斑病菌株。致病力分析表明，ＣＨＢ－３的致病力比較強，病情指數達到89．３。對Ｙ２１ｃ菌株的核糖體ＲＮＡ基因內轉錄間隔區進行ＰＣＲ擴增和序列測定，并在ＧｅｎＢａｎｋ中進行Ｂｌａｓｔ搜索和比對分析，根據ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析結果并結合病菌的形態學特征，初步認為河南省棉花黑斑病的病原菌為細極鏈格孢菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ）。利用平板對峙培養測定了７個木霉菌株對棉花黑斑病菌株ＣＨＢ－３的拮抗作用，篩選到抑菌作用較好的木霉菌株ＴＨ，抑菌率為８８．６％。

關鍵詞：棉花；黑斑病；木霉；ｒＤＮＡ－ＩＴＳ

中圖分類號：Ｓ４３６．４２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）09－1793-04

Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｃａｕｓｉｎｇ Ｃｏｔｔｏｎ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ Ｌｅａｆ Ｓｐｏｔ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ Ｓｔｒａｉｎｓ

ＣＨＥＮ Ｋａｉ１，ＬＩＵ Ａｉ－ｒｏｎｇ１，２，ＷＵ Ｓｈａｎｇ－ｙｉｎｇ１，ＬＩＮ Ｘｉａｏ－ｍｉｎ１，ＸＵ Ｔｏｎｇ２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｈｅｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌｕｏｙａｎｇ ４７１００３， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２９， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ has ｓｐｒｅａｄ ａｒｏｕｎｄ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅｌｙ ａｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ． Ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｖｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ by Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｍｅ ａｒｅａｓ ｏｆ Ｈｅｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｆｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒＤＮＡ－ＩＴＳ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ２ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ and ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ， ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ． Ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｎｆｒｏｎｔｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ， ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｅｖｅｎ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ ｓｔｒａｉｎｓ ａｇａｉｎｓｔ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ． ＴＨ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｅｈａｖｅｄ ｂｅｓｔ as ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ８８．６％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｔｔｏｎ； Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ； Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ； ｒＤＮＡ－ＩＴＳ

棉花黑斑病是世界范圍內廣為傳播的一種常見的棉葉侵染性病害［１］，又稱棉花輪紋病，俗稱腰折病，多發于棉花子葉、真葉以及幼苗期。它的病原體為半知菌亞門大鏈格孢屬真菌，被稱為棉花輪紋菌或棉花黑斑病菌。它是棉花苗期葉部病害中分布最廣、流行面積最大、流行頻率最高的病害，陰濕多雨年份往往猖獗流行，給棉花生產造成毀滅性災害［１，２］。

棉花黑斑病的病原菌有多種，其中以大孢鏈格孢菌（Ａ． ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ Ｚｉｍｍ．） 、細極鏈格孢菌（Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ Ｗｉｌｔｓｈ．）、棉鏈格孢菌［Ａ． ｇｏｓｓｙｐｉｎａ （Ｔｈｕｍ．） Ｈｏｐｋ．］、細交鏈孢菌［Ａ． ａｌｔｅｒｎａｔａ （Ｆｒ．） Ｋｅｉｓｓｌ．］等為常見種［２］。不同病原菌間致病力不同，大孢鏈格孢菌致病力最強。目前，棉花黑斑病病原菌研究多集中在發病條件和化學防治方面，對其病原菌的鑒定及生物防治報道較少，還沒有關于河南地區棉花黑斑病病原田間致病力和生物防治的研究報道。本研究從河南省部分地區感染黑斑病的棉花葉片上采集并分離病原菌，并對其致病力、病原及其生防木霉進行了研究，以期為棉花黑斑病的生物防治奠定理論基礎。

１材料與方法

１．１材料

棉花黑斑病菌由本課題組分離。哈茨木霉菌菌株ＴＡ、ＴＤ、ＴＧ、ＴＨ、ＴＩ、ＴＭ及ＴＸ，由浙江大學徐同教授饋贈。供試棉花品種為新植１號。

１．２棉花黑斑病菌的分離

從洛陽、三門峽、周口市和河南省農業科學院的田間采集發病較重且癥狀典型的棉花葉片，取病健交界處組織，先用體積分數為７５％的乙醇消毒３０ ｓ，再用質量分數為１％的ＮａＣｌＯ消毒５ ｍｉｎ，用無菌水清洗。消毒后的組織塊置于ＰＤＡ平板培養基上，２５℃恒溫培養２ ｄ，長出真菌菌落后挑取邊緣菌絲單孢純化，分離純化得到的菌株接種到ＰＤＡ斜面培養基上。

１．３病原菌的形態學鑒定

分離純化后的菌落產孢后，挑取少量菌絲和分生孢子，觀察菌絲及分生孢子形態，測量分生孢子的長、寬、分隔數及孢子梗的有無、長短，每個處理至少測量３０個孢子，并對照文獻［３］進行形態鑒定。

１．４病菌對棉花幼苗的致病力測定

幼苗４～５片真葉時，用滅菌后的蒸餾水將枝條及葉片沖洗干凈，再用濕潤紗布輕搓葉片表面，去除表面蠟質。采用噴霧法將孢子懸浮液均勻噴灑在葉片表面，病原菌孢子懸浮液濃度為１０８個／ｍＬ，以清水作對照。重復３次，每重復２０株。將處理后的棉花植株放入人工氣候箱中，并用塑料袋將整株罩住。溫度、相對濕度、光照時間分別設置為２９℃、９０％和１５ ｈ。１４ ｄ后調查發病情況，統計病情指數。

病情分級：０級，無病癥；１～５級分別為病斑占葉片表面積的０～２０％、２１％～４０％、４１％～６０％、６１％～８０％和８１％～１００％。

病情指數＝［∑（各級病葉數×各級代表值）/（調查總葉數×最高級代表值）］×１００

１．５病菌核糖體ＲＮＡ基因內轉錄間隔區序列比較

以ＣＴＡＢ法提取病菌總ＤＮＡ。ｒＤＮＡ－ＩＴＳ擴增選用的引物為ＩＴＳ４（５’－ＴＣＣ ＴＣＣ ＧＣＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣ－３’）和ＩＴＳ５（５’－ＧＧＡ ＡＧＴ ＡＡＡ ＡＧＴ ＣＧＴ ＡＡＣ ＡＡＧ－３’）。ＰＣＲ反應體系含ＤＮＡ模板１．００ μＬ（約１０ ｎｇ）、１０×緩沖液（１ ０００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ ｍｍｏＬ／Ｌ ＫＣｌ）２．５０ μＬ、Ｍｇ２＋（２５ ｍｍｏＬ／Ｌ ＭｇＣｌ２）１．８０ μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｅａｃｈ） ２．５０ μＬ、引物（２ μｍｏＬ／Ｌ）各1．００ μＬ、Ｔａｑ酶１．２５ μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ至２５．００ μＬ。反應程序為：９４℃預變性２ ｍｉｎ；９４℃變性４０ ｓ，５４℃退火４０ ｓ，７２℃延伸４０ ｓ，共３５個循環；７２℃延伸１０ ｍｉｎ。反應產物在質量濃度１．２％瓊脂糖凝膠上電泳檢測（１２０Ｖ，３０ ｍｉｎ）。擴增的ＰＣＲ產物委托上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

１．６木霉拮抗菌株的室內篩選

采用對峙培養法。木霉菌和病原菌ＣＨＢ－３于２８℃活化３ ｄ。挑取直徑５ ｍｍ的病原菌菌塊，接種到新制ＰＤＡ平板左側，再將木霉菌塊接種到平板右側。以只接種病原菌平板作對照，每處理３次重復。２８℃恒溫培養６ ｄ，每天記錄病原菌落指向木霉菌半徑以及對照病原菌菌落半徑，計算抑菌率。

抑菌率＝［（病原菌對照菌落半徑－病原菌落指向木霉菌半徑）/病原菌對照菌落半徑］×１００％

拮抗系數的分級標準（５級）［４］：Ⅰ級，木霉菌絲占平皿面積的１００％；Ⅱ級，木霉菌絲占平皿面積的２／３以上；Ⅲ級，木霉菌絲占平皿面積的１／３～２／３；Ⅳ級，木霉菌絲占平皿面積的１／３以下；Ⅴ級，病原菌絲占平皿面積的１００％。

１．７數據處理

應用ＤＰＳ ｖ ７．０５軟件進行數據分析，采用鄧肯氏法進行差異顯著性檢驗。

２結果與分析

２．１棉花黑斑病病原菌致病力比較

從采集到的標本中共分離到５株病原菌，分別編號為：ＣＨＢ－１、ＣＨＢ－２、ＣＨＢ－３、ＣＨＢ－４、ＣＨＢ－５。將病菌孢子懸浮液噴灑于健康葉片，接種４８ｈ后部分植株葉面出現紅褐色小圓斑，以幼嫩葉片為主。此后病斑逐漸明顯，擴展成不規則形至近圓形褐色斑，清水對照未發病。接種后第六天計算不同菌株的病情指數，結果表明不同菌系之間的致病力存在極顯著差異，ＣＨＢ－３的致病力比較強，病情指數達到８９．３（表１）。

２．２病原菌的形態學鑒定

在ＰＤＡ培養基上接種病原菌后，菌絲呈放射狀向外生長，后呈圓形，邊緣整齊。菌落淡褐色，生長茂密，沒有氣味。菌落生長后期，有明顯環狀輪紋，背面中心有褐色代謝產物產生（圖１）。分生孢子倒棍棒形，部分孢子卵圓形或倒梨形，基部圓，暗褐色，嘴孢短，成串著生，有橫隔１～９個，縱隔０～６個，隔膜處縊縮，大小１２．５～４２．５ μｍ×６．０～１２．５ μｍ。根據形態學數據將ＣＨＢ－３初步鑒定為半知菌亞門，叢梗孢目，暗色孢科，鏈格孢屬真菌［５，６］。

２．３棉花黑斑病菌ｒＤＮＡ－ＩＴＳ的擴增及序列比較

以病菌總ＤＮＡ為模板，用通用引物ＩＴＳ４和ＩＴＳ５分別對致病力較強的ＣＨＢ－２、ＣＨＢ－３、ＣＨＢ－５菌株的ＩＴＳ區段進行擴增和序列測定，拼接后分別得到長度為５９６、５８５、５７４ ｂｐ的序列。采用ＤＮＡＭＡＮ５．２．２軟件對測得的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列進行比對，發現這３株真菌的ＩＴＳ序列完全相同。通過Ｂｌａｓｔ搜索，發現與所測菌株的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列相似率為１００％的序列（表２）中，有4個來自細極鏈格孢（Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ），５個來自煙草赤星病菌（Ａ． ａｌｔｅｒｎａｔa），５個來自鏈格孢屬真菌（Ａ． ｓｐ．），４個來自未鑒定的子囊菌，１個長柄鏈格孢（Ａ． ｌｏｎｇｉｐｅｓ）和１個蘋果輪斑病菌（Ａ． ｍａｌｉ）。根據棉花病株癥狀及病菌的形態特征，結合ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析，所分離的棉花黑斑病病原菌鑒定為細極鏈格孢（Ａ． ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ）。

２．４木霉菌對黑斑病原菌的抑制作用

對峙培養２～３ ｄ木霉菌即表現出對病原菌ＣＨＢ－３的抑制作用。培養４ ｄ后木霉菌與病原菌接觸，木霉菌和病原菌之間形成了較明顯的抑制圈，大部分木霉菌在與病原菌的對峙中形成了對抗生長局面。隨著時間的推移，被包圍的病原菌有些邊緣塌陷，菌落背面褐色加深，生長受到抑制。培養到第六天時與枯萎病菌形成了明顯的抑菌圈。其中ＴＡ和ＴＨ菌株覆蓋或侵入了黑斑病菌ＣＨＢ－３菌落，拮抗作用較強（圖２）。

各菌株對棉花黑斑病菌ＣＨＢ－３的抑制作用存在差異，當木霉菌接種６ ｄ時，對病原菌的抑菌率在５６．７％～８８．６％之間。其中木霉菌ＴＨ對黑斑病菌ＣＨＢ－３具有較強的抑制作用，抑菌率為８８．６％，拮抗系數為Ⅰ～Ⅱ級；ＴＡ菌株的抑菌效果次之（表３）。

３討論

黑斑病是棉花苗期葉片病害中分布最廣，危害最大，流行頻率最高的一種毀滅性病害，在我國主要產棉區都有發生，尤其是北方棉區，在陰濕多雨年份極易發生流行。對棉花黑斑病的研究主要是利用化學殺菌劑和預處理非致病性生防制劑。Ｓｈｔｉｅｎｂｅｒｇ 等［7］的研究表明，系統性殺菌劑（戊唑醇）和保護性殺菌劑（代森錳）對棉花黑斑病均具有較好的防治效果，不同殺菌劑對碧瑪棉產量和生長沒有顯著影響，但系統性殺菌劑在抑制已感染病害上具有更好效果。Ｊａｂａｊｉ－Ｈａｒｅ等［８］研究了非致病性的雙核絲核菌和苯并噻二唑（ＢＴＨ）對棉花黑斑病的防治效果，結果表明非致病性的雙核絲核菌防病效果要優于ＢＴＨ，且兩者在抗病中具有協同作用。本研究進行了棉花黑斑病病原菌的分離、形態鑒定，并基于ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列進行了分子鑒定，并首次利用哈茨木霉對其進行了室內抑菌研究。

木霉菌是重要的植物病害防治菌，它可通過重寄生、抗生溶菌作用、競爭作用、誘導抗性及促進植物生長等機制抑制真菌病害［９］。本試驗研究了７個哈茨木霉菌株對棉花黑斑病病原菌的拮抗作用，并篩選得到較理想的拮抗木霉菌株ＴＨ和ＴＡ。目前木霉菌在實驗室、溫室控制條件下或田間小型試驗中已獲得較好的防治效果，但與在大田應用還有較大的差距。主要是田間環境條件復雜，如土壤物理化學因素、土壤微生物、植物根系和氣象因素等［１０］。本試驗結果為將哈茨木霉菌株ＴＨ和ＴＡ等開發成生防制劑提供了依據，但關于ＴＨ和ＴＡ等菌株防治田間棉花黑斑病的施用方法、次數和劑量等尚待進一步探討。

參考文獻：

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