大麗輪枝菌拮抗細菌多粘芽孢桿菌7-4菌株的篩選與鑒定

摘要：為篩選對棉花黃萎病病原菌大麗輪枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）具有拮抗作用的芽孢細菌，采用改良的瓊脂平板擴散法，通過初篩從各地的土樣中分離到８４株拮抗細菌菌株，再對其進行復篩，得到１株具有較強抑菌活性的拮抗細菌７－４菌株，并對該菌株進行了形態特征觀察和生理生化鑒定，初步判斷其為多粘芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）。

關鍵詞：大麗輪枝菌；拮抗細菌；篩選；鑒定；多粘芽孢桿菌

中圖分類號：Ｓ４７６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）09－1797-03

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｔｒａｉｎ ７－４ ａｇａｉｎｓｔ

Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ

ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｙｉｎｇａ，ＭＥＮＧ Ｃｈｅｎｇ－ｓｈｅｎｇａ，ＬＥＩ Ｂａｉ－ｓｈｉｂ

（ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ；ｂ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１， Ｈｅｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ， ８４ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｏｉｌ in ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ areas ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｅｄ by ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｇａｒ ｐｌａｔｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｖｉａ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ． Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ， ａ ｓｔｒａｉｎ ｃａｌｌｅｄ ７－４ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ． According to ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ characters， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，the strain 7-4 ｗａｓ preliminarily ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ； ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ．）引起的一種真菌性病害，此病原菌首先于１９１４年在美國的弗吉尼亞州被發現，隨后蔓延到世界上其他的產棉國，１９３５年傳入中國［１］。目前，棉花黃萎病已經蔓延到全國各產棉區，并造成嚴重的經濟損失，防治難度較大，至今尚無特效的防治藥劑，已成為棉花生產的主要障礙之一。現階段只能依靠以種植抗病品種為主的綜合防治措施，但由于高抗黃萎病的棉花品種少，且對大麗輪枝菌致病的機理以及棉花抗黃萎病的遺傳方式了解還比較少。因此，在目前缺乏有效抗源的情況下，生物防治將是一種重要的輔助防治手段［２］。而獲得高效拮抗菌是生物防治的基礎。產芽孢菌是自然界廣泛存在的一類細菌，其中一部分可以產生抗菌肽、大環脂、環脂等十幾種抗菌物質，從而起到抑制或防治作物病害的作用［３－６］。

本試驗從不同來源的土樣中篩選大麗輪枝菌的拮抗芽孢細菌，以期獲得具有較好生物防治潛力的拮抗菌株并對其進行生理生化鑒定。

１材料和方法

１．１供試病原菌

大麗輪枝菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂ．）Ｖ－１９０菌株，由河北農業大學生物制藥實驗室保存。

１．２培養基

ＮＡ培養基、ＮＢ培養基、馬鈴薯培養基（ＰＤＡ）成分及制備參見文獻［７］，生理生化鑒定培養基制備及試劑參照文獻［８］。

１．３試驗方法

１．３．１土樣采集從邢臺、保定、唐山、邯鄲、滄州等地的棉田中取１０～１５ ｃｍ深處土樣，風干后，保存于牛皮紙袋中。記錄采樣時間、地點等信息。

１．３．２土壤中芽孢細菌的分離純化取土樣１．０ ｇ研細，加入裝有９．０ ｍＬ無菌水的試管中搖勻，８０ ℃水浴３０ ｍｉｎ，然后取１．０ ｍＬ進行１０倍梯度稀釋至１０－６，分別取１０－４、１０－５、１０－６ ３個梯度的稀釋液０．１ ｍＬ涂布在ＮＡ培養基平板上，３７ ℃倒置培養２４ ｈ。挑取形態、大小、色澤不同的單菌落分別轉接至ＮＡ斜面上，并分別進行菌株編號，３７ ℃培養２４ ｈ，置于４ ℃冰箱保存備用［９］。同時采用平板劃線法檢測每株菌的純度。

１．３．３大麗輪枝菌混菌平板的制備向培養１０ ｄ左右的大麗輪枝菌斜面加５．０ ｍＬ無菌水，用接種環輕輕刮取斜面上的孢子，搖勻，形成孢子懸液。再將孢子懸液加入融化后冷卻到５０ ℃左右的ＰＤＡ培養基中，迅速搖勻，倒平板，凝固待用。

１．３．４大麗輪枝菌拮抗細菌的初篩取制備好的大麗輪枝菌混菌平板，用接種環從分離到的細菌斜面上挑取少許菌體點種在ＰＤＡ平板上，２４℃培養３ ｄ，挑選出有抑菌圈的拮抗菌株備用。

１．３．５大麗輪枝菌拮抗細菌的復篩將初篩獲得的拮抗細菌活化后接種于裝有５０ ｍＬ ＮＢ培養基的２５０ ｍＬ三角瓶中，于３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ搖床上振蕩培養４８ ｈ。

在制備大麗輪枝菌混菌平板時，向培養基中加入終濃度為０．２５ μｇ／ｍＬ鏈霉素，放冷后，用打孔器打出一定數量均勻的孔，分別向每孔中加入７０ μＬ培養４８ ｈ的拮抗細菌發酵液上清，靜置３０ ｍｉｎ，２４ ℃培養３ ｄ。測量抑菌圈直徑，挑選出抑菌圈大且清晰的菌株［１０］作為目的菌株，用于后續試驗。

１．３．６菌株的形態特征觀察采用稀釋涂平板法將適當濃度的目的菌株菌懸液涂布在ＮＡ平板上，靜置３０ ｍｉｎ，３７ ℃倒置培養２４ ｈ，觀察菌落形態特征。

從３７ ℃培養２４ ｈ的斜面上挑取少量目的菌株的菌體進行革蘭氏染色和芽孢染色，染色方法參見文獻［８］，顯微鏡下觀察其菌體和芽孢形態。

１．３．７菌株的生理生化鑒定根據《常見細菌鑒定手冊》［８］及《伯杰細菌鑒定手冊》［１１］中相應屬、種鑒定有關的內容，選取了以下生理生化試驗對目的菌株進行鑒定：Ｖ．Ｐ試驗、酪素水解試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、淀粉水解試驗、過氧化氫酶試驗、硫化氫產生試驗、糖發酵試驗、檸檬酸鹽試驗、甲基紅試驗、耐鹽試驗、酪氨酸水解試驗。

２結果與分析

２．１拮抗細菌的初篩結果

從土樣中共分離得到４００余個菌株，經初篩獲得８４株拮抗菌株，其中有１８株產生的抑菌圈直徑較大、抑菌能力較好（表１）。

２．２拮抗細菌的復篩結果

將初篩獲得的拮抗能力較好的１８株菌株進行復篩，其中４株拮抗菌株（４－５９、７－４、８－５４、１２－２３）的發酵液上清液表現拮抗活性。對復篩得到的４株拮抗細菌所分泌的拮抗物質進行抗菌活性的比較，結果發現７－４菌株的無菌拮抗物質溶液對大麗輪枝菌表現的拮抗活性最高（表２，圖１）。

２．３７－４菌株的菌落特征

７－４拮抗菌株在ＮＡ平板上單菌落呈圓形，邊緣整齊，不透明，乳白色，表面微有皺褶，不光滑，呈饅頭狀（圖２）。

２．４７－４菌株的菌體特征

７－４菌株細胞經染色后在顯微鏡下觀察呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性，菌體大小為０．７～０．８ μｍ×２．０～３．０ μｍ；可形成內生芽孢，芽孢囊明顯膨脹，芽孢橢圓形、中生到次端生、稍膨大（圖３）。

２．５７－４菌株的生理生化鑒定結果

７－４菌株的生理生化鑒定結果見表３。結合７－４菌株的形態特征和生理生化特征綜合考察，根據《伯杰細菌鑒定手冊》［１１］初步判斷其為多粘芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）。

３討論

試驗中某些初篩活性很高的菌株進入復篩后，其抑菌活性明顯降低，甚至消失，這可能是由于抑菌機制不同（比如營養競爭與分泌抗菌素），或者是培養條件不合適所導致的，如果換用其他培養基或優化培養基配方，應該還可以獲得抑菌效果不錯的菌株。事實也證明當適當改變培養基配方時，以前抑菌活性較弱的菌株其抑菌活性有明顯提高，這也表明發酵條件對拮抗物質的產生具有重要影響。

本試驗復篩是采用搖瓶發酵，再用其發酵液上清進行抑菌活性檢測，因此本試驗復篩獲得的４株拮抗細菌產生的抑菌物質可以認為是胞外產物，而且產生的抑菌圈在室溫放置一個月后，抑菌圈中仍無病原菌長出，說明其性質比較穩定。其后對其進行了鑒定，發現這些抑菌物質均為蛋白（或多肽），因此在后續的研究中，可以進行發酵條件的優化、拮抗多肽的分離純化、蛋白多肽的基因克隆等。

生物防治作為棉花黃萎病最有前景的防治方法之一，在防治棉花黃萎病，最大限度地降低該病害造成的損失，提高棉花生產的經濟效益和社會效益方面具有重大意義。芽孢桿菌作為植物病害生防細菌之一，由于其抗逆性強，抗菌譜廣泛，對多種病原真菌、細菌均有較強的抑制作用，而引起研究者的廣泛關注。目前，生防研究所涉及的芽孢桿菌種類主要有枯草芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、多粘芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｌｙｍｙｘａ）、蠟狀芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、地衣芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等［１２－１５］。因此，本試驗主要是針對產芽孢細菌進行篩選，這樣便于菌劑商品的保存，也可以使試驗成果更便捷地在農業生產中應用。

參考文獻：

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