培氟沙星人工抗原的合成與鑒定

摘要：試驗采用碳二亞胺（ＥＤＣ）法將培氟沙星（ＰＥＦＸ）與載體蛋白進行偶聯，用于制備免疫抗原ＰＥＦＸ－ＢＳＡ與包被抗原ＰＥＦＸ－ＯＶＡ，通過紫外掃描和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ對人工抗原進行鑒定，免疫原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，獲得抗體。試驗結果表明，間接ＥＬＩＳＡ方法檢測小鼠血清抗體效價達到１∶６ ４００。為進一步制備抗ＰＥＦＸ單克隆抗體提供了良好的免疫原。

關鍵詞：培氟沙星；人工抗原；合成；鑒定

中圖分類號：Ｓ８５９．８４文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）11－2278-02

Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎｓ

ＦＡＮ Ｇｕｏ－ｙｉｎｇ，ＬＩＵ Ｊｕｎ－ｗｅｉ，ＺＨＯＮＧ Ｈｕａ，ＣＨＥＮ Ｊｕｎ－ｊｉｅ

（Ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｕｐｌｅ ｐｅｆｌｏｘａｃｉｎ ｗｉｔｈ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ＰＥＦＸ－ＢＳＡ ａｎｄ ｃｏａｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ＰＥＦＸ－ＯＶＡ． Ａｆｔｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｓｃａｎｎｉｎｇ ａｎｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，ｔｈｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ Ｂａｌｂ／ｃ ｍｉｃｅ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｔｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ ｓｅｒｕｍ ｒｅａｃｈｅｄ

１∶６ ４００ ｂｙ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｍｅｔｈｏｄ． Ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｇｏｏｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ＰＥＦＸ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： pｅｆｌｏｘａｃｉｎ； aｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ； sｙｎｔｈｅｓｉｓ； iｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

培氟沙星（Ｐｅｆｌｏｘａｃｉｎ，ＰＥＦＸ），又名培氟哌酸，為第三代喹諾酮類抗菌藥。具有廣譜抗菌作用，不易產生耐藥性［１］。但因培氟沙星易引起人的過敏反應，出現一些毒理作用，如心臟毒性、光毒性反應、軟骨毒性及肌腱損傷、肝臟、腎臟毒性等而停止研發、試驗及臨床應用［２］。ＰＥＦＸ是小分子化合物，必須與大分子載體蛋白偶聯才能作為免疫原。ＰＥＦＸ結構中含有羧基，可通過中間物ＮＨＳ在ＥＤＣ等有機溶劑的作用下與蛋白質的氨基結合形成偶聯物，該試驗利用偶聯劑人工合成ＰＥＦＸ完全抗原，為進一步制備ＰＥＦＸ單克隆抗體提供優良的免疫原。

１材料與方法

１．１試驗材料

１．１．１試劑乳酸培氟沙星標準品（９９．６％）購自中國獸醫藥品監察所；碳二亞胺（ＥＤＣ）、卵清蛋白（ＯＶＡ）、牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、Ｎ－羥基琥珀酰亞胺（ＮＨＳ）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Ｓｉｇｍａ公司，其他試劑均為國產分析純。

１．１．２主要儀器ＨＩ９３２１酸度計（美國ＨＡＮＮＡ公司）；ＣＪＪ－７８１Ｃ型磁力攪拌器（上海浦江分析儀器廠）；Ｕ－３０００紫外掃描儀（日本島津）；７２２型光柵分光光度計（日本島津）。

１．１．３試驗動物６周Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，河南科技學院殘留物檢測實驗室飼養。

１．２方法

１．２．１完全抗原的制備采用碳二亞胺法［３，４］并加以改進。準確稱取Ｎ－羥基琥珀酰亞胺（ＮＨＳ）２．８８ ｍｇ，碳二亞胺（ＥＤＣ）１０．２３ ｍｇ，培氟沙星（ＰＥＦＸ）３．２６ ｍｇ，加入２３０ μＬ的Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺（ＤＭＦ）。此溶液稱為Ａ，并在室溫下遮光攪拌孵育２４ ｈ。

準確稱取牛血清白蛋白（ＢＳＡ）２６．４ ｍｇ，加入０．０１ ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ值７．４）磷酸鹽緩沖液（ＰＢＳ）１．７２ ｍＬ，此溶液稱為Ｂ。將孵育好的溶液Ａ逐滴加入到Ｂ，邊加邊攪拌，室溫下攪拌３ ｈ。

反應結束，用０．０１ ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ值７．４）ＰＢＳ透析，透析后溶液定容至３ ｍＬ，－２０℃分裝保存。

同法合成包被抗原培氟沙星—卵清蛋白（ＰＥＦＸ－ＯＶＡ）。

１．２．２完全抗原的鑒定ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝膠電泳鑒定，紫外掃描鑒定參見文獻［５］。

１．２．３動物免疫用ＰＥＦＸ－ＢＳＡ免疫８周齡Ｂａｌｂ／ｃ小鼠８只，免疫方法參見文獻［５］。

２結果與分析

２．１ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鑒定結果

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鑒定結果見圖１。由圖１可見，人工抗原ＰＥＦＸ－ＢＳＡ與ＢＳＡ進行比較，人工抗原泳道條帶出現明顯的拖尾，即可判斷偶聯成功［６］。

２．２紫外掃描鑒定結果

紫外掃描鑒定結果見圖２。由圖２可見，ＰＥＦＸ－ＢＳＡ特征吸收峰在２７５ ｎｍ處，不同于ＢＳＡ的２７８ ｎｍ，也不同于ＰＥＦＸ的２７１ ｎｍ。從理論上說，游離的藥物全部透析出來后，該峰只能是由偶聯到載體蛋白上的ＰＥＦＸ所提供，進一步說明偶聯成功［７］。

２．３動物免疫試驗結果

每只免疫鼠的多抗血清效價均達到了１∶６ ４００，達到了試驗的預期目標，免疫抗原ＰＥＦＸ－ＢＳＡ免疫小鼠后產生了特異性的具有高度親和力的抗體。

３討論

培氟沙星屬小分子化合物，必須與載體蛋白偶聯才具有免疫原性。該試驗采用碳二亞胺法進行偶聯，反應條件溫和，在較低的溫度下也能在中性ｐＨ值中進行，但是此法沒有選擇性，易形成蛋白質間的聚合物而產生沉淀，所以采用兩步法偶聯：先將含羧基的培氟沙星分子ＥＤＣ反應，活化羧基，再加入蛋白反應物，以此來減少蛋白質間的交聯［８］。能否產生相應抗體才是判定人工抗原合成是否成功的關鍵［９］。動物免疫試驗結果表明，合成的免疫原可以刺激小鼠產生針對目的抗原具有高親和力的特異性抗體，這充分說明利用該法合成的免疫原有效。該試驗結果為下一步單克隆抗體的制備以及免疫學快速檢測方法的建立奠定了基礎。

參考文獻：

［１］ 王少敏，李秀霞． 培氟沙星的不良反應［Ｊ］． 天津藥學，２００３，

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［２］ 顏承農，童金強，熊丹，等． 熒光光譜法研究培氟沙星與牛血清白蛋白結合反應特征［Ｊ］．分析化學，２００６，３４（６）：７９６－８００．

［３］ ＤＵＡＮ Ｊ，ＹＵＡＮ Ｚ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｆｏｏｄ ａｎｉｍａｌ ｅｄｉｂｌｅ ｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］． Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００１，４９（３）：１０８７－１０８９．

［４］ ＨＯＬＴＺＡＰＰＬＥ Ｃ Ｋ，ＢＵＣＫＬＥＹ Ｓ Ａ，ＳＴＡＮＫＥＲ Ｌ Ｈ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｏｎｏｌｏｎｅ ｓａｒａｆｌｏｘａｃｉｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］． Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９７（９）：１３－２６．

［５］ ＨＯＬＴＺＡＰＰＬＥ Ｃ Ｋ，ＣＡＲＬＩＮ Ｒ Ｊ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈａｐｔｅｎ－ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｂｙ ｎｏｎｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９３，１６４（２）：２４５－２５３．

［６］ 郭堯君． 蛋白質電泳實驗技術［Ｍ］． 北京：科學出版社，２００１．

［７］ 周恩祥，劉福成． 農藥人工抗原的合成研究進展［Ｊ］． 農藥，２００５，４４（８）：３３７－３４１．

［８］ 楊利國，胡少昶，魏平華，等． 酶免疫測定技術［Ｍ］． 南京：南京大學出版社，１９９８．２４２－２８６．

［９］ 李俊鎖，邱月明，王超． 獸藥殘留分析［Ｍ］． 上海：上海科學出版社，２００２．２９４．

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