敗醬草中總黃酮的提取工藝優(yōu)化及含量動(dòng)態(tài)變化

摘要：以敗醬草為原料，分析提取時(shí)間、料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素對(duì)敗醬草總黃酮含量的影響，以Ｌ９（３４）正交試驗(yàn)方法優(yōu)化總黃酮的提取工藝，然后在該工藝條件下考察了不同部位、不同采摘時(shí)期敗醬草中總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)也對(duì)超聲波在提取敗醬草中總黃酮的效果進(jìn)行了探索。結(jié)果表明，提取時(shí)間、料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)敗醬草總黃酮含量均有影響；敗醬草中總黃酮提取的最佳工藝組合為體積分?jǐn)?shù)為5０％的乙醇以１∶２０的料液比在6０℃條件下提取２.0 ｈ；引入超聲波技術(shù)后，提取總黃酮的含量有所提高；同時(shí)發(fā)現(xiàn)敗醬草嫩葉中總黃酮的含量最高。

關(guān)鍵詞：敗醬草；總黃酮；超聲波；含量變化

中圖分類號(hào)：S567.9；Ｒ２８４．２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）11－2301-04

Extraction and the Dynamic Content of Total Flavonoids in Patrina

ＬＡＮ Ｔａｏ－ｆａｎｇ，ＬＵ Ｊｉａ－ｋｕｎ，ＬＩ Ｘｕｅ－ｆｅｉ，ＬＩＵ Ｘｉｎ－ｊｉａ，ＰＩＡＯ Ｌｉ，ＭＥＮＧ Ｌｉａｎｇ－ｙｕ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ｉｎ Ｂｏｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｚｈｏｕ １２１０１３，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐａｔｒｉｎａ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； ａｎｄ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ ｐａｔｒｉｎａ ｄｕｒｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ． Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ， ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｓｏｌｉｄ to ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｌ９（３４） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ａｒｒａｙ ｄｅｓｉｇｎ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｓ ａｌｓｏ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ 5０％ ｅｔｈａｎｏｌ ｗｉｔｈ ａ ｓｏｌｉｄ to ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ ｏｆ １∶２０ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｆｏｒ ２.0 ｈ ａｔ 6０℃． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ａｎｄ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｎ ｔｅｎｄｅｒ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐａｔｒｉｎａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐａｔｒｉｎａ； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ； content variation

敗醬草（Ｈｅｒｂａ ｐａｒｔｉｎｉａｅ），又稱澤敗、苦菜等，屬敗醬科多年生草本植物。敗醬草是我國(guó)常用中草藥，具有清熱解毒之功效，野生敗醬草廣泛存在于自然界［１，２］，研究表明，敗醬草含有較高的黃酮、皂苷等活性物質(zhì)，敗醬草葉粗提物具有明顯的抗氧化、抗腫瘤及抗菌等藥理功效；研究發(fā)現(xiàn)敗醬草具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的維生素、氨基酸和礦物質(zhì)，在我國(guó)的許多地方被作為野生蔬菜食用，由此可見敗醬草不僅是一個(gè)安全性高的中藥材而且還是一較好的天然抗氧化劑［３，４］。大量研究表明，黃酮類化合物具有抗自由基、抗氧化、抗癌、抗菌、抗過敏、抗炎癥等多種生理活性及藥理作用，且無毒副作用［５］。黃酮類化合物具有抗氧化的效果，可減少自由基對(duì)人體的傷害。目前對(duì)敗醬草的研究還不夠深入，對(duì)其中黃酮類化合物的研究也不夠豐富，沒有使這一中草藥的價(jià)值得到最大的發(fā)揮。因此研究敗醬草中的黃酮類化合物具有較大的實(shí)際意義。本研究對(duì)敗醬草中總黃酮的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)不同部位、不同采集時(shí)期的敗醬草中總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，旨在確定敗醬草中總黃酮的最佳提取工藝條件和最佳采集時(shí)期及應(yīng)用部位，為敗醬草的綜合開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１敗醬草敗醬草老葉購(gòu)自藥店，產(chǎn)地遼寧，敗醬嫩葉和根自當(dāng)?shù)匾巴獠杉?/p>

１．１．２試劑蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，無水乙醇、硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、苯酚均為分析純，去離子水。

１．１．３儀器雙光束紫外可見分光光度計(jì)，７２２Ｎ可見分光光度計(jì)，高速離心機(jī)，１０１Ｂ－２型電熱鼓風(fēng)干燥箱，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)。

１．２方法

１．２．１蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品２００ ｍｇ，用７０％乙醇定容到１００ ｍＬ容量瓶中，放冷，精密吸取５．０ ｍＬ，置于５０ ｍＬ容量瓶?jī)?nèi)，用水稀釋至刻度，得０．２ ｍｇ／ｍＬ蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取０、２、４、６、８、１０ ｍＬ蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液至２５ ｍＬ容量瓶中，加３０％的乙醇溶液至１０ ｍＬ，加入５％的亞硝酸鈉溶液０．７ ｍＬ，搖勻，靜置５ ｍｉｎ，再加入５％的硝酸鋁溶液０．７ ｍＬ，搖勻，靜置５ ｍｉｎ，加入１ ｍｏｌ／ｍＬ的氫氧化鈉溶液５．０ ｍＬ，最后用３０％乙醇溶液定容到刻度線，搖勻，靜置５ ｍｉｎ后，在最大吸收峰處測(cè)定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（Ｃ）為橫坐標(biāo)，所測(cè)吸光度（Ａ）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用線性回歸的方法，求回歸方程。

１．２．２樣品處理與敗醬草中總黃酮提取敗醬草用去離子水洗凈后自然陰干，粉碎，過４０目篩，脫脂烘干后，乙醇回流法提取，準(zhǔn)確稱取４ ｇ敗醬草加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，浸提黃酮類物質(zhì)。

１．２．３敗醬草提取物中總黃酮含量測(cè)定［６－９］采用硝酸鋁顯色法，以蘆丁為標(biāo)樣，在５１０ ｎｍ處測(cè)定其吸光度，測(cè)定總黃酮的含量。吸取提取液０．５ ｍＬ，置于２５ ｍＬ容量瓶?jī)?nèi)，加入５％的亞硝酸鈉０．７ ｍＬ，搖勻后靜置５ ｍｉｎ，加入１０％的硝酸鋁０．７ ｍＬ，搖勻后靜置５ ｍｉｎ，再加入１ ｍｏｌ／ｍＬ的氫氧化鈉５ ｍＬ，用３０％的乙醇溶液定容至２５ ｍＬ，靜置５ ｍｉｎ后在５１０ ｎｍ處測(cè)定其吸光度，參比為不含提取液的空白試劑，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程即可知提取液中總黃酮含量。

１．２．４單因素試驗(yàn)分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同）、提取時(shí)間對(duì)敗醬草總黃酮含量的影響。

１．２．５正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定以提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為試驗(yàn)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素與水平見表１，優(yōu)化敗醬草中總黃酮的提取工藝。

２結(jié)果與分析

２．１蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為＝１０．１４３ ０Ｃ＋０．００５ ６，ｒ＝０．９９９ ２（圖１）。

２．２單因素試驗(yàn)

２．２．１提取時(shí)間對(duì)敗醬草總黃酮提取率的影響在提取溫度為７０℃，料液比為１∶２０，乙醇體積分?jǐn)?shù)為６０％的條件下，研究提取時(shí)間對(duì)敗醬草總黃酮提取率的影響（圖２）。結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的增加，總黃酮的提取率也逐漸增加，提取２．０ ｈ時(shí)達(dá)到最大值，然后提取率逐漸下降，因此，選擇２．０ ｈ為總黃酮提取的最佳提取時(shí)間。

２．２．２提取溫度對(duì)敗醬草總黃酮提取率的影響在提取時(shí)間為２．０ ｈ，料液比為１∶２０，乙醇體積分?jǐn)?shù)為６０％的條件下，研究提取溫度對(duì)敗醬草總黃酮提取率的影響（圖３）。結(jié)果表明，在一定溫度范圍內(nèi)，總黃酮的提取率隨著溫度的升高而增加，溫度超過７０℃時(shí)，總黃酮得率增幅放緩，總黃酮提取時(shí)要防止溫度過高而引起化合物的分解，因此，最適溫度設(shè)為６０～８０℃。

２．２．３料液比對(duì)敗醬草總黃酮提取率的影響在提取時(shí)間為２．０ ｈ，提取溫度為７０℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為６０％的條件下，研究料液比對(duì)敗醬草總黃酮含量的影響（圖４）。結(jié)果表明，隨著溶劑量的增加，總黃酮含量明顯增加，在料液比為１∶２０后趨于穩(wěn)定，當(dāng)黃酮類物質(zhì)完全溶出后，即使繼續(xù)加大溶劑的量，總黃酮含量基本趨于穩(wěn)定。綜合考慮，最適料液比設(shè)為１∶２０。

２．２．４乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)敗醬草總黃酮提取率的影響在提取時(shí)間為２．０ ｈ，提取溫度為７０℃，料液比為１∶２０時(shí)，研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)敗醬草總黃酮提取率的影響（圖５）。結(jié)果表明，在乙醇體積分?jǐn)?shù)小于６０％的乙醇溶液中，總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加，超過６０％后，總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加為減少，這是由于敗醬草黃酮類物質(zhì)種類很多，不同種類黃酮極性不同，按相似相溶原理，在乙醇體積分?jǐn)?shù)６０％時(shí)，溶液極性有利于大多數(shù)黃酮類物質(zhì)溶解。因此，最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為６０％。

２．３正交試驗(yàn)結(jié)果分析

采用Ｌ９（３４）正交試驗(yàn)進(jìn)行敗醬草總黃酮提取，確定總黃酮最佳提取條件，試驗(yàn)結(jié)果見表２。由表２可知，各因素對(duì)總黃酮提取率的影響主次順序?yàn)椋海?Ｃ＞Ｂ＞Ｄ。根據(jù)正交試驗(yàn)可以確定敗醬草中總黃酮最佳提取工藝條件為Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ2即提取時(shí)間為２．０ｈ，提取溫度為6０℃，料液比為１∶２０，乙醇體積分?jǐn)?shù)為5０％。

２．４敗醬草不同部位總黃酮含量的比較

根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，在敗醬草中總黃酮最佳提取條件下對(duì)敗醬草嫩葉和根中總黃酮分別進(jìn)行提取，結(jié)果見圖６，由圖６可以看出，敗醬草不同部位總黃酮含量變化規(guī)律為：嫩葉＞老葉＞根。

２．５超聲波對(duì)敗醬草中總黃酮提取的影響［１０-１２］

根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果，使用超聲波輔助提取，超聲波外接水浴鍋保證提取溫度，提取時(shí)間為３０ ｍｉｎ，后續(xù)提取時(shí)間縮短３０ ｍｉｎ，以維持總的提取時(shí)間不變，然后進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定，結(jié)果見圖７。測(cè)得總黃酮含量分別為：嫩葉２．１３％，根１．６８％，老葉１．８６％。由結(jié)果可以看出，超聲波破壁有利于總黃酮的提取。

３結(jié)論

試驗(yàn)研究了敗醬草中總黃酮的最優(yōu)提取條件。通過正交試驗(yàn)確定最佳提取條件：提取時(shí)間２．０ ｈ，提取溫度6０℃，料液比１∶２０，乙醇體積分?jǐn)?shù)5０％。

測(cè)得總黃酮的含量為老葉１．７５％，嫩葉２．０４％，根１．５９％。可以看出，不同部位或不同采摘時(shí)間，敗醬草中總黃酮的含量有所差異，其總的變化規(guī)律為：嫩葉＞老葉＞根，因此，對(duì)敗醬草的開發(fā)利用，嫩葉的價(jià)值更高。

引入超聲波提取后，則總黃酮含量為老葉１．８６％，嫩葉２．１３％，根１．６８％，不管是那一部位，何時(shí)采摘，超聲波對(duì)提取敗醬草中黃酮類物質(zhì)均有改善。應(yīng)用超聲波進(jìn)行黃酮類物質(zhì)的提取，經(jīng)過３０ｍｉｎ的破壁，總黃酮的提取率有所提高，但提高的幅度不同，由于本研究未對(duì)超聲波作進(jìn)一步的研究，而是只用了一種頻率、一個(gè)超聲時(shí)間，所以會(huì)造成應(yīng)用超聲波的效果不太明顯，但起碼證明應(yīng)用超聲波這一手段對(duì)提取是有好處的，這一點(diǎn)有待于以后進(jìn)一步研究。

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文