黃孢原毛平革菌產木素過氧化物酶發酵條件的優化

摘要：對白腐菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）產木素過氧化物酶的發酵條件進行了研究。在單因素試驗的基礎上用正交試驗進行工藝參數的優化。結果表明，木素過氧化物酶的最佳培養條件為培養１３ ｄ、接種０．５ ｍＬ，料液比１∶２．５（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ）、培養溫度２５℃，酶活為７７１ Ｕ／ｍＬ。

關鍵詞：白腐菌 Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ；木素過氧化物酶；正交試驗

中圖分類號：Ｑ５５文獻標識碼： Ａ文章編號：0439－８114（２０11）11－2305-03

Optimization of Production of Lignin Peroxidase by Phanerochaete chrysosporium

ＷＡＮＧ Ｍｉｎ１，２，ＷＡＮＧ Ｊｉｅ２

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｎｇｓｈｕｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｅｎｇｓｈｕｉ ０５３０００，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅbｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｒａｆｔ ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｂｙ ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔ ｆｕｇｉ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ， ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ， １３ｄ； ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ， ０．５ ｍＬ； solid to liquid ratio， 1∶25（W/V，g∶mL）ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ２５℃； ｌｉｐ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ７７１ Ｕ／ｍＬ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔ ｆｕｇｉ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ； Ｌｉｇｎｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ

白腐菌是已知的惟一能在純系培養中有效地將木質素降解為ＣＯ２和Ｈ２Ｏ的一類微生物［１，２］，是迄今為止最有效、最主要的木質素降解微生物，在自然界的碳素循環中起著關鍵作用［３］。重要的木素降解酶有３種，木素過氧化物酶（Ｌｉｇｎｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＬｉＰ，ＥＣ．１．１１．１．７）、錳過氧化物酶（Ｍａｎｇａｎｅｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＭｎＰ，ＥＣ．１．１１．１．７）和漆酶（Ｌａｃｃａｓｅ，ＥＣ．１．１０．３．２）。ＬｉＰｓ是該酶系的主要成分，在木質素降解中起關鍵性作用。大多數白腐菌僅產生２種甚至１種分解木質素的酶［４－６］。木素降解酶不僅降解木質素，而且通過催化自由基鏈式反應，對環境中難降解有機污染物具有高效、廣譜的降解功能。故利用白腐菌處理工業廢水、生物制漿、土壤修復等是目前生物技術應用研究中的熱點課題。對黃孢原毛平革菌分泌胞外酶的條件進行優化，旨在對白腐菌的工業化應用和生物質的高效利用提供一定的理論依據。

１材料與方法

１．１材料

甜高粱秸稈，于２００８年１０月取自河北農業大學標本園，經烘箱干燥后用中藥粉碎機粉碎，過４０目篩，備用；黃孢原毛平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ），購自中國工業微生物菌種保藏中心；ＰＤＡ培養基： 去皮馬鈴薯２００ ｇ，加水１ ０００ ｍＬ煮沸３０ ｍｉｎ，濾去馬鈴薯，濾液補足至１ ０００ ｍＬ，葡萄糖２０ ｇ，瓊脂１５ ｇ，１２１℃滅菌１５ ｍｉｎ。主要用于活化菌種；固態發酵培養基：甜高粱秸稈粉２０ ｇ，葡萄糖０．４ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．０６ ｇ，水４０ ｇ，１２１℃滅菌１５ ｍｉｎ。

１．２方法

１．２．１不同發酵條件對木質素酶活影響的正交試驗根據單因素試驗，確定最佳水平。進行正交試驗，因素與水平設計見表１。

１．２．２酶活測定粗酶液的制備：在秸稈發酵過程中，每２ ｄ取出２ ｇ發酵樣品，加入緩沖液浸提，３０℃水浴振蕩浸提１ ｈ。然后過濾，離心（３ ５００ ｒ／ｍｉｎ，１５ ｍｉｎ）后取上清液用于酶活測定。

木素過氧化物酶（ＬｉＰ）活力測定［７］：取０．２ ｍＬ藜蘆醇溶液（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ），０．４ ｍＬ酒石酸緩沖液（２５０ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值為３．０）與０．４ ｍＬ粗酶液混勻，即得１ ｍＬ反應液。于３０℃向此反應液中加２０ μＬ Ｈ２Ｏ２溶液（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ）啟動酶促反應，并在３１０ ｎｍ波長下測定反應１ ｍｉｎ前后的反應液吸光度變化。一個酶活力單位（Ｕ）定義為每分鐘氧化藜蘆醇產生１ μｍｏｌ藜蘆醛所需的酶量。

２結果與分析

２．１不同發酵時間對酶活性的影響

不同發酵時間對黃孢原毛平革菌產木素酶活的影響見圖１。由圖１可知，發酵時間為１４ ｄ時，木素過氧化物酶酶活最高，為６７２ Ｕ／ｍＬ。

２．２不同碳源對酶活性的影響

碳源是構成菌體碳架及能量的來源，真菌細胞干重的１／２是由碳組成。碳源在真菌生長過程中占很重要的地位。白腐菌在降解木素時需要外加碳源，一般為糖類，高碳／低氮有利于木素降解［８］。試驗以不同碳源取代基礎培養基中的葡萄糖，考察它們對木質素酶合成的影響。在初始培養基中分別采用不同碳源（果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精），測定產酶狀況，發現酶活力隨不同碳源而異，如圖２所示。添加葡萄糖產生木素過氧化物酶的酶活最高，為７２０ Ｕ／ｍＬ，因此確定葡萄糖為木素過氧化物酶最佳碳源。

２．３不同氮源對酶活性的影響

在初始培養基中分別采用不同氮源（尿素、碳酸氫銨、草酸銨、檸檬酸三銨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨），考察氮源對酶活的影響。由圖３可知，在以硝酸銨為氮源的培養物中木素過氧化物酶酶活最高，為７２２ Ｕ／ｍＬ。

２．４不同溫度對酶活的影響

微生物的增殖受溫度的影響較大。由圖４可知，在２０、２５、３０℃下，木素過氧化物酶酶活差異較大，以２５℃酶活最高。在此溫度下木素過氧化物酶酶活為７２２ Ｕ／ｍＬ。

２．５不同接種量對酶活的影響

接種量小會使發酵周期延長；接種量大能促進菌體迅速增殖，但會使培養基黏度增大，影響溶氧，衰老細胞增加，發酵后勁不足，發酵產物產量較小。由圖５可知，最佳接種量為１．０ ｍＬ，木素過氧化物酶酶活為６９６ Ｕ／ｍＬ。

２．６不同料液比對酶活的影響

固態發酵基質含水量是影響固態發酵的成功與否的關鍵。發酵初期，適當的濕度可以促進孢子的萌發和菌絲體的生長，濕度過大一方面會影響培養基的通透性，不利于散熱和氣體流通；另一方面， 若濕度過大，濕熱滅菌時培養基凝結成塊，菌絲體只能在團狀固體物料的表面生長，不能深入到內部，降低了菌絲體對固體物料的利用率。由圖６可知，物料與水分比例為１∶２．５（Ｗ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同）時酶活最高，木素過氧化物酶酶活為６９９ Ｕ／ｍＬ。

２．７正交試驗

表２為正交試驗結果。由表２可知，影響木素過氧化物酶酶活的主次順序為Ｄ＞Ｂ＞Ａ＞Ｃ，即培養溫度＞接種量＞培養時間＞料液比。最佳發酵條件為Ａ2Ｂ１Ｃ３Ｄ２，即培養時間為１0 ｄ，接種量為０．５ ｍＬ， 料液比為１∶２．５，培養溫度為２５℃，在此條件下進行驗證試驗，重復３次，木素過氧化物酶酶活為７７１ Ｕ／ｍＬ。

表３是正交試驗的方差分析結果。由表３可知培養時間、接種量、料液比、培養溫度４個因素中只有培養溫度對木素過氧化物酶酶活的影響顯著。

３結論

白腐菌系好氧菌，培養方式對產酶影響非常明顯。在試驗中采用振蕩培養白腐菌的方式，通過正交試驗確定了木素過氧化物酶的最佳培養條件為培養１0 ｄ、接種０．５ ｍＬ、料液比１∶２．５、培養溫度２５℃，酶活可達７７１ Ｕ／ｍＬ。

白腐菌是一種能降解木質素的真菌，那么利用木質素類農業廢棄物如各種作物的秸稈作為培養基進行固體發酵，既滿足了白腐菌生長的原始生態環境而有利于其生長，同時又可以對農業廢物進行再利用，這樣不僅降低了大規模生產漆酶的成本，更重要的是減少了農業污染。

參考文獻：

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［８］ 阮芳勇． 青霉菌Ｐ６產木素過氧化物酶的發酵條件優化［Ｄ］． 北京：中國農業大學，２００５．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文