秦美獼猴桃高頻遺傳轉化再生體系的建立

摘要：以秦美獼猴桃莖段為外植體，在原代培養成功獲得無菌試管苗的基礎上，進行愈傷組織誘導培養。將獲得的秦美獼猴桃愈傷組織轉入再分化培養基中，采用正交設計試驗，添加不同種類及不同濃度的植物生長調節物質，組成９種不同的再生植株分化培養基，對秦美獼猴桃愈傷組織進行再分化培養。結果表明，誘導培養基中添加１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ暗培養，有利于秦美獼猴桃愈傷組織的形成，誘導率達１００．０％；再分化培養基中添加３．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．1 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋５０ ｇ／Ｌ蔗糖，能明顯提高秦美獼猴桃愈傷組織再分化率。這種方法把誘導愈傷組織與再分化分開進行，可以獲得更多的愈傷組織進行再分化培養基的優化，也有利于進行秦美獼猴桃的遺傳轉化研究。

關鍵詞：秦美獼猴桃；組織培養；愈傷組織；再分化

中圖分類號：Ｓ６６３．４；Ｑ８１３文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）14－2993-02

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ （Ｑｉｎｍｅｉ）

ＹＵＡＮ Ｙｕｎ－ｘｉａｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｅｉｎａｎ Ｔｅａｃｈｅｒｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｉｎａｎ ７１４０００，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｔｅｍｓ ｏｆ Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａ ｃｖ． Ｑｉｎｍｅｉ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｃａｌｌｕｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｇａｉｎｅｄ ａｓｅｐｔｉｃ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ． Ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｃａｌｌｉ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｐｌａｃｅｄ ｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｓｕｃｈ ａｓ ６－ＢＡ ａｎｄ ＮＡＡ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｃｏｍｐｏｓｅ ｔｈｅ ９ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ Ｌ９（３４） ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｄｄｉｎｇ １.0 ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ ａｎｄ ０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ ｉｎ ｄａｒｋ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｔｏ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｏｎ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｒａｔｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｓ ｈｉｇｈ ａｓ １００％． Ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ＭＳ＋ ３．０ ｍｇ／Ｌ ６ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋50 g/L ｓｕｃｒｏｓｅ； ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｈｏｏｔｓ． Ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｈｏｏｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｉｓ method; and more callus could be obtained for further study； thus was advantageous to kiwifruit genetic transformation.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｃａｌｌｕｓ； ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ

獼猴桃是雌雄異株植物，倍性復雜，雜交育種周期長［１］。因此，組織培養技術已成為獼猴桃快速繁殖的重要途徑［２］。在組織培養過程中，不同種類植物生長調節劑以及同一種植物生長調節劑的不同濃度都會影響獼猴桃愈傷組織植株的再生［３－５］。開展不同植物生長調節劑對獼猴桃愈傷組織植株再生的影響研究，有利于篩選出一種高效快速的獼猴桃愈傷組織植株再生方法，為獼猴桃大規模生產、遺傳轉化及品種改良研究奠定基礎。

１材料與方法

１．１材料

以西安市長安區優質栽培的秦美獼猴桃的一年生帶腋芽枝條為試驗材料。

１．２方法

１．２．１秦美獼猴桃無菌苗原代培養剪取秦美獼猴桃一年生帶腋芽枝條的新嫩枝，用自來水沖洗附著的泥土、灰塵等雜物，放入燒杯中，加入適量洗衣粉，再在自來水下沖洗約２ ｈ后，再用去離子水沖洗５ ｍｉｎ，于超凈工作臺內，先用體積分數為７５％的酒精處理３０ ｓ，再用１ ｇ／L升汞處理１２ ｍｉｎ，然后用無菌去離子水沖洗５～６次，切成約１．０～１．５ ｃｍ的帶節莖段作外植體，接種于ＭＳ基本培養基（不添加任何激素，附加３０ ｇ／Ｌ蔗糖及8 ｇ／Ｌ瓊脂，ｐＨ值為５．８）上，進行原代培養。

１．２．２秦美獼猴桃愈傷組織的誘導待秦美獼猴桃原代無菌苗長至３～５ ｃｍ時，在超凈工作臺內，將嫩苗的莖段剪成１ ｃｍ左右接種于不同的誘導培養基上。以ＭＳ＋３０ ｇ／Ｌ蔗糖＋8 ｇ／Ｌ瓊脂作為基本成分，分別添加６－ＢＡ ０．０、０．５、１．０、１．５、２．０ ｍｇ／Ｌ和ＮＡＡ ０．０、０．１、０．２ ｍｇ／Ｌ，組成１５種誘導培養基，在２４～２６ ℃條件下暗培養，誘導愈傷組織形成，３周后統計誘導率，并觀察愈傷組織生長狀態。

１．２．３秦美獼猴桃愈傷組織的再分化誘導培養３周后，將結構致密、淡黃綠色愈傷組織小心切下，分別接種于不同的再分化培養基上。每瓶接種５塊組織，培養溫度（２５±１）℃、光照強度１ ５００～２ ０００ ｌｘ、每天光照時間１３ ｈ。分化培養基的篩選采用正交設計Ｌ９（３４）［６］，設置３個因素分別為６－ＢＡ、ＮＡＡ、蔗糖，每個因素設置３個水平（表１）。每個試驗３次重復。

２結果與分析

２．１無菌苗原代培養

秦美獼猴桃一年生帶腋芽枝條的莖段原代培養２周左右，從節段處長出３～５ ｃｍ長新的嫩苗。此嫩苗后期生長較快，加上培養基中無需定期加水培養，減少了污染的機會，此外，在材料不充分的條件下，這是一種高效的外植體快繁的好方法。

２．２不同濃度６－ＢＡ和ＮＡＡ對秦美獼猴桃愈傷組織誘導的影響

以無菌苗莖段為外植體進行暗培養，１周左右就能在莖的兩端開始看到愈傷組織，質地致密，顏色淡黃綠。從表２可以看出，培養基中沒有添加任何植物生長調節劑的培養組合，不能誘導出愈傷組織。在添加０．５～２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ時，愈傷組織誘導率相應提高，添加１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ時誘導率達１００．０％。而當只添加０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ時，誘導率為７０．８％，同時附加６－ＢＡ和ＮＡＡ時，誘導率有所提高，誘導率最高、愈傷組織質地好且調節劑用量較合適培養組合是添加１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ的培養基。

２．３不同因素對秦美獼猴桃愈傷組織再分化的影響

在按照正交設計的Ｌ９（３４）秦美獼猴桃愈傷組織再分化培養基中，秦美獼猴桃愈傷組織都能不同程度地分化出再生苗（表３）。從表３直觀分析得出，適宜再分化的培養基為ＭＳ＋３．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．1 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋５０ ｇ／Ｌ蔗糖，影響最大的為６－ＢＡ，其次為ＮＡＡ，最小為蔗糖。通過方差分析可以看出，６－ＢＡ各水平間差異極顯著，而ＮＡＡ和蔗糖各水平間的差異不顯著（表４）。用再分化培養基ＭＳ＋３．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．1 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋５０ ｇ／Ｌ蔗糖進行愈傷組織再分化培養確認試驗，在再分化培養３５ ｄ后進行統計，再分化率可達到８６％左右，再生苗生長正常。因此，可以確定秦美獼猴桃愈傷組織再分化培養基為ＭＳ＋ ３．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．1 ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋５０ ｇ／Ｌ蔗糖。

３討論

秦美獼猴桃愈傷組織誘導時，培養條件采用暗培養，愈傷組織誘導率較高而且有利于愈傷組織的再分化，這與畢靜華等［７］的研究相一致。植物生長調節劑是影響愈傷組織再分化的關鍵性因素之一。ＺＴ和６－ＢＡ都是誘導獼猴桃愈傷組織再生植株時常用的細胞分裂素［８］，但由于ＺＴ價格較貴，６－ＢＡ是比較實用的，它完全可以替代ＺＴ。同時由于ＮＡＡ和６－ＢＡ有協同作用，這與葛新玲等［９］的報道一致。試驗在獲得原代無菌苗的基礎上，用原代苗莖段作為外植體進行秦美獼猴桃愈傷組織誘導。再將秦美獼猴桃愈傷組織轉入分化培養基中分化培養，而不是在誘導愈傷組織的同時直接就進行芽的誘導，這種方法可以獲得更多的愈傷組織進行再分化培養基的優化，也有利于進行秦美獼猴桃的遺傳轉化研究。

參考文獻：

［１］ 秦永華，張上隆，朱道圩，等． 獼猴桃的組織培養和遺傳轉化研究進展［Ｊ］． 細胞生物學雜志，２００４，２６（１）：５７－６１．

［２］ 文國琴，石大興，吳雪梅，等． 獼猴桃組織培養研究的現狀與進展［Ｊ］． 北方果樹，２００４（３）：１－４．

［３］ ＨＩＲＳＣＨ Ａ Ｍ，ＴＥＳＴＯＬＩＮ Ｒ． Ｅｍｂｒｙｏ ｒｅｓｃｕｅ ｆｒｏｍ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒｏｓｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ａｃｔｉｎｉｄｉａ （Ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ）［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２００１，２０（６）：５０８－５１６．

［４］ 田娜，徐子勤，何近剛． 獼猴桃高頻直接再生體系的建立［Ｊ］． 武漢植物學研究，２００７，２５（１）：７９－８３．

［５］ 王大平． 不同濃度的激素組合對獼猴桃愈傷組織誘導及芽分化的影響［Ｊ］． 安徽農業科學，２００７，３５（３６）：１１７６１，１１８２１．

［６］ 方開泰，馬長興． 正交與均勻試驗設計［Ｍ］． 北京：科學出版社，２００１．

［７］ 畢靜華，劉永立，ＳＹＥＤ Ａ． 闊葉獼猴桃葉片離體器官發生和植株再生［Ｊ］． 果樹學報，２００５，２２（４）：４０５－４０８．

［８］ ＨＡＲＡＤＡ Ｈ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｒｇａｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ＰＬ． ａｓ ａ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｊ Ｈｏｒｔ Ｓｃｉ，１９７５，５０：８１－８３．

［９］ 葛新玲，朱立武． 獼猴桃高效離體再生體系的研究［Ｊ］． 中國農學通報，２００８，２４（１０）：３７３－３７６．

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