東北鐵線蓮中木犀草素及總黃酮含量的測定

摘要：選用木犀草素和蘆丁為對照品，采用高效液相色譜法和分光光度法分別測定了東北鐵線蓮中木犀草素及總黃酮的含量，色譜柱為Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ），以甲醇－０．４％磷酸溶液（３０∶７０，V/V） 為流動相，流速為１．０ｍＬ／ｍｉｎ，梯度洗脫，木犀草素的檢測波長為３５０ ｎｍ，進樣量為２０ μＬ，柱溫４０ ℃，總黃酮的檢測波長為５１０ ｎｍ。結果表明，木犀草素進樣濃度在０．５~２０．０ μｇ／ｍＬ范圍內線性關系良好（r＝０．９９９ ４），平均回收率為９９．２１％，ＲＳD值為２．７２％；蘆丁進樣濃度在８．０４～４８．２４ μｇ／ｍＬ范圍內線性關系良好（r＝０．９９９ ９），平均回收率為９９．３４％，ＲＳＤ值為１．９７％。采用高效液相色譜法和分光光度法測定東北鐵線蓮中木犀草素及總黃酮的含量，方法簡便、準確，可以用于東北鐵線蓮的質量控制。

關鍵詞：東北鐵線蓮；木犀草素；蘆丁；高效液相色譜法；分光光度法

中圖分類號：ＴＱ２４４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）14－2958-04

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｕｔｅｏｌｉｎ ａｎｄ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍａｎdｓｈｕｒｉｃａ Ｒｕｐｒ．

ＺＨＯＮＧ Ｆａｎｇ－ｌｉ，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｌｉｎ，ＨＵＡＮＧ Ａｉ－ｚｈｅｎ

（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｊｉｌｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｊｉｌｉｎ １３２０２２， Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｌｕｔｅｏｌｉｎ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍａｎdｓｈｕｒｉｃａ Ｒｕｐｒ. ｗas ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ ａｎｄ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ＣＨ３ＯＨ－０．４％ Ｈ３ＰＯ４（３０∶７０，V/V） ｗｉｔｈ Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ， ５ μｍ） ｃｏｌｕｍｎ． Ｔｈｅ ２０ μＬ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｔ ４０ ℃ at the ｒａｔｅ ｏｆ １．０ ｍＬ／ｍｉｎ and detected ａｔ ３５０ ｎｍ ａｎｄ ５１０ ｎｍ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｐｅａｋ ａｒｅａ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｌｕｔｅｏｌｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．５～２０．０ μｇ／ｍＬ（R＝０．９９９ ４）． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｌｕｔｅｏｌｉｎ ｗａｓ ９９．２１％ ｗｉｔｈ ＲＳＤ ｏｆ ２．７２％． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ also ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｐｅａｋ ａｒｅａ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｌｕｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ８．０４～４８．２４ μｇ／ｍＬ（R＝０．９９９ ９）． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｌｕｔｉｎ ｗａｓ ９９．３４％ ｗｉｔｈ ＲＳＤ ｏｆ １．９７％． Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ were ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ thus could ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃ. ｍａｎdｓｈｕｒｉｃａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍａｎdｓｈｕｒｉｃａ Ｒｕｐｒ.； ｌｕｔｅｏｌｉｎ； ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ； ＨＰＬＣ； ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ

東北鐵線蓮（Ｃｌｅｍａｔｉｓ ｍａｎdｓｈｕｒｉｃａ Ｒｕｐｒ．）為毛茛科鐵線蓮屬植物，主要分布于東北及內蒙北部地區，一般根部入藥，嫩葉、地上莖可食用，東北鐵線蓮中含有豐富的生物活性物質，主要用于治療風濕痹痛、關節不利等癥狀，現代藥理研究表明具有多種藥理作用，如解痙、鎮痛抗炎、抗腫瘤、利膽和降血壓等功效［１－３］。

總黃酮作為一類重要的天然有機化合物，因其具有眾多藥理作用如抗癌抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮痛、抑菌抗病毒、抗氧化抗衰老而越來越受到人們的關注［４］，木犀草素是一種重要黃酮化合物，在自然界分布廣泛，具有良好抗氧化性［５］和抗菌性［６］，具有降低血脂和膽固醇，降壓及免疫雙向調節藥理作用［７］，可作為食品天然抗氧化劑和防腐劑開發，具有廣闊開發與應用前景。

目前關于東北鐵線蓮中總黃酮和木犀草素的含量測定尚未見報道，該文建立了東北鐵線蓮中總黃酮和木犀草素的含量測定方法，為東北鐵線蓮的綜合利用提供科學的理論依據。

１材料與方法

１．１材料與試劑

東北鐵線蓮購自安徽省亳州市華申藥業有限公司；木犀草素和蘆丁對照品均購自中國藥品生物制品檢定所（木犀草素批號１１１５２０－２００５０４，供含量測定用；蘆丁批號１０００８０－２００７０７，供含量測定用）；甲醇（色譜純，天津大茂化學試劑公司）；水為二次蒸餾水；其余所用試劑均為分析純。

１．２儀器

ＬＣ－１０ＡＤ型高效液相色譜儀配備（日本島津公司），ＳＰＤ－１０Ａｖｐ紫外－可見檢測器；７５２Ｎ紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；超聲波藥品處理機（濟寧金百特電子有限責任公司ＪＢＴ/Ｃ－ＹＣＬ）；ＢＰ２１１Ｄ 型電子天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；ＲＴ－０８手提式高速中藥粉碎機（大德樂機械有限公司）。

２方法與結果

２．１木犀草素含量測定

２．１．１色譜條件參照文獻［８－１１］分別對甲醇－水、甲醇－０．２％（Ｖ／Ｖ）磷酸溶液和甲醇－０．４％（Ｖ／Ｖ）磷酸溶液三種流動相進行了選擇，結果表明甲醇－０．４％（Ｖ／Ｖ）磷酸溶液為流動相時，分離度為３．１５８，理論塔板數為１６ ３９３，保留時間約為３０ ｍｉｎ左右，以梯度洗脫方式對木犀草素進行洗脫，洗脫程序為０ ｍｉｎ到１５ ｍｉｎ，４０％Ａ到６０％Ａ；１５ ｍｉｎ到２０ ｍｉｎ，６０％Ａ到７０％ Ａ；２０ ｍｉｎ到３０ ｍｉｎ，７０％Ａ到８０％Ａ；３０ ｍｉｎ到３５ ｍｉｎ，８０％Ａ到９５％Ａ；３５ ｍｉｎ 到４５ ｍｉｎ，９５％Ａ；４５ ｍｉｎ 到５５ ｍｉｎ，９５％Ａ到３０％Ａ；５５ ｍｉｎ 到６０ ｍｉｎ，３０％Ａ～停泵，其中Ａ為甲醇，Ｂ為０．４％（Ｖ／Ｖ）磷酸溶液。根據以上試驗結果確定色譜條件：色譜柱［１２］為Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ， ５ μｍ）；流動相為甲醇－０．４％磷酸溶液（Ｖ／Ｖ＝３０∶７０）；流速： １．０ ｍＬ／ｍｉｎ，梯度洗脫；柱溫：４０℃，進樣量２０ μＬ，檢測波長為 ３５０ ｎｍ。分別取對照品溶液，供試品溶液各２０ μＬ，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，結果見圖１、２。

本實驗采用紫外分光光度計對木犀草素對照品溶液進行全波長掃描，以甲醇作為空白試劑，結果木犀草素的最大吸收波長為３５０ ｎｍ與早期文獻報道一致［９，１０］，最終確定木犀草素的檢測波長為３５０ ｎｍ。

２．１．２對照品溶液的制備取木犀草素對照品適量，精密稱定，加甲醇配制為８０ μｇ／ｍＬ對照溶液。

２．１．３供試品溶液的制備稱取２．０ ｇ東北鐵線蓮藥粉，加入２０ ｍＬ甲醇，搖勻。超聲提取４５ ｍｉｎ，靜置，冷卻至室溫，過濾，用５ ｍＬ甲醇清洗濾渣一次，過濾，合并濾液，轉移至２５ ｍＬ容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用０．４５ μｍ微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

２．１．４方法線性范圍考察精密吸取木犀草素對照品適量，分別配制成濃度為０．５，１．０，２．０，４．０，８．０、１０．０和２０．０ μｇ／ｍＬ的梯度溶液，分別吸取各梯度溶液２０ μＬ，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以木犀草素對照品進樣濃度Ｃ（μｇ／ｍＬ）為橫坐標，峰面積積分值Ａ為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程Ａ＝６６６．８７０Ｃ＋４５．７８７，ｒ＝０．９９９ ４，結果表明木犀草素進樣濃度在０．５０～２０．００ μｇ／ｍＬ范圍內呈良好的線性關系。

２．１．５精密度實驗精密吸取線性關系項下濃度為１０．０ μｇ/ｍＬ的對照品溶液，連續進樣５次，測定木犀草素吸收峰面積積分值，ＲＳＤ值為１．７０％，表明本實驗精密度良好。實驗結果見表１。

２．１．９樣品測定取５份東北鐵線蓮藥粉，按“２．１．３”項下的的制備方法制備供試品溶液，按２．１．１色譜條件測定，測得木犀草素的含量分別為２９．１２５、２９．０２０、３０．７８８、３０．３４８、３０．５７８ μｇ／ｇ，平均含量為２９．９７２ μｇ／ｇ，由此可知東北鐵線蓮中木犀草素的含量較低。

２．２總黃酮含量測定

２．２．１對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品０．２０１ ｇ，加６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇稀釋到１００ ｍＬ，搖勻，即得濃度為２．０１ ｍｇ／ｍＬ的對照品溶液。

２．２．２供試品溶液的制備稱取２．０ ｇ東北鐵線蓮藥粉，精密稱定，置５０ ｍＬ容量瓶中，加入６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇２０ ｍＬ，搖勻，超聲提取３０ ｍｉｎ，靜置，冷卻至室溫，過濾，濾渣重復上述超聲提取過程１次，濾過，濾渣用５ ｍＬ ６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇清洗１次，過濾，合并２次所得濾液，加６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇定容至５０ ｍＬ，搖勻，得供試品溶液。

２．２．３檢測波長的選擇吸取蘆丁對照品溶液和供試品溶液各２ ｍＬ于２５ ｍＬ容量瓶中，加６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇４ ｍＬ，搖勻，靜置６ ｍｉｎ，加５％（ｍ／Ｖ）ＮａＮＯ２ ０．４ ｍＬ，搖勻，靜置６ ｍｉｎ，加１０％（ｍ／Ｖ）Ａｌ（ＮＯ３）３ ０．４ ｍＬ，搖勻，靜置６ ｍｉｎ，再加入４％（ｍ／Ｖ）ＮａＯＨ ４ ｍＬ，搖勻，用６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇定容到刻度，放置１５ ｍｉｎ，同時作空白對照，在４００～６００ ｎｍ范圍內進行波長掃描［１３］，結果對照品溶液和供試品溶液均在５１０ ｎｍ有最大吸收，由此確定檢測波長為５１０ ｎｍ。

２．２．４方法線性范圍考察分別精密移取０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６ ｍＬ蘆丁對照品溶液于２５ ｍＬ容量瓶中，加６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇４ ｍＬ，搖勻，靜置６ ｍｉｎ，加５％（ｍ／Ｖ）ＮａＮＯ２ ０．４ ｍＬ，搖勻，靜置６ ｍｉｎ，加１０％（ｍ／Ｖ）Ａｌ（ＮＯ３）３ ０．４ ｍＬ，搖勻，靜置６ ｍｉｎ，加４％（ｍ／Ｖ）ＮａＯＨ ４ ｍＬ，搖勻，用６０％（Ｖ／Ｖ）乙醇定容到刻度，放置１５ ｍｉｎ，同時作空白對照，分別在５１０ ｎｍ波長處測定吸光度，以對照品濃度Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）為橫坐標，吸光度Ａ為縱坐標，繪制標準曲線。求得回歸方程Ａ＝１１．７４８Ｃ＋０．００３，ｒ＝０．９９９ ９，結果表明蘆丁進樣濃度在０．００８ ０４～０．０４８ ２４ ｍｇ／ｍＬ范圍內呈良好的線性關系。

２．２．５精密度實驗吸取標準曲線項下濃度為０．０１６ ０８ ｍｇ／ｍＬ的蘆丁對照品溶液２ ｍＬ，按“２．２．４”項下方法連續測定５次吸光度，記錄數據，結果ＲＳＤ值為０．９５％，精密度良好。

２．２．６穩定性實驗稱取２．０ ｇ東北鐵線蓮藥粉，精密稱定，置５０ ｍＬ容量瓶中，按“２．２．２”項下方法配制供試品溶液，按“２．２．４”項下方法，分別于配制后０、３０、６０、９０和１２０ ｍｉｎ測定吸光度，ＲＳＤ值計算結果為１．６２％，表明供試品溶液在實驗條件下１２０ ｍｉｎ內基本穩定，可滿足測定要求。

２．２．７重復性實驗取同一批東北鐵線蓮藥粉，按“２．２．２”項下的制備方法制備５份供試品溶液，依法測定吸光度，結果ＲＳＤ值為１．３９％，重復性較好。

２．２．８加樣回收率實驗稱取已知含量（４．４２５ ｍｇ/ｇ）的東北鐵線蓮藥粉約２ ｇ，共５份，精密稱定，分別精密加入蘆丁對照品溶液２．０ ｍＬ，按“２．２．２”項下的制備方法制備５份供試品溶液，按“２．２．４”項下方法測定吸光度，結果表明平均回收率為９９．３４％，ＲＳＤ值為１．９７％。實驗結果見表５。

２．２．９樣品測定取５份東北鐵線蓮藥粉，按“２．２．２”項下的的制備方法制備５份供試品溶液，按“２．２．４”項下方法測定吸光度，結果測得總黃酮的含量分別為４．４３７、４．４２４、４．４０６、４．３９７、４．４３７ ｍｇ/ｇ。

３討論

３．１高效液相色譜法檢測波長的選擇

文獻報道，采用高效液相色譜法測定木犀草素含量時，一般分別在３５０ ｎｍ［９，１０］，２５４ ｎｍ［１１］的檢測波長條件下進行了研究，本實驗采用紫外分光光度計對木犀草素對照品溶液進行全波長掃描，以甲醇作為空白試劑，結果木犀草素的最大吸收波長為３５０ ｎｍ，根據實驗結果和參考文獻確定３５０ ｎｍ為本實驗的檢測波長。

３．２高效液相色譜法分離柱的選擇

根據參考文獻［１２］，選擇的色譜柱為Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１８（２５０ ｍｍ× ４．６ ｍｍ，５ μｍ，）。

３．３高效液相色譜法供試品溶液制備方法的選擇

根據所查閱的文獻［８］，本實驗以甲醇為溶劑，分別對熱回流法、索氏提取以及超聲提取３種提取方式進行選擇。結果熱回流法木犀草素峰面積、拖尾因子分別為７２０．９０６、２．０７１，索氏提取法木犀草素峰面積、拖尾因子分別為６３７．４００、２．１７９，超聲提取法木犀草素峰面積、拖尾因子分別為１ ５５２．３００、１．５７２，根據木犀草素的峰面積、拖尾因子確定超聲提取為較佳的提取方法，并在此基礎上進行了超聲次數、超聲時間進行了探索。

３．３．１超聲次數的選擇本實驗考察了超聲次數對提取效果的影響，精密稱取２．０ ｇ東北鐵線蓮粉末，提取２次，每次加入２０ ｍＬ甲醇，每次超聲提取４５ ｍｉｎ，過濾，分別收集１、２次提取液，將各次提取液分別置于２５ ｍＬ容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。用微孔濾膜（０．４５ μｍ）過濾，取濾液作為供試品溶液，按正文色譜條件進行含量測定，第１次提取液測得的木犀草素峰面積１ ６９８．０５６，第２次提取液在相應的保留時間處沒有吸收峰，由此可見第２次的提取量已經很小，故將提取次數確定為１次。

３．３．２超聲時間的選擇在超聲次數對提取效果的影響實驗的基礎上，進一步考察了超聲時間對提取效果的影響，精密稱取２．０ ｇ東北鐵線蓮粉末，加入２０ ｍＬ甲醇提取１次，分別超聲３０、３５、４０、４５、５０ ｍｉｎ，過濾，分別收集提取液，將各提取液分別置于２５ ｍＬ容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（０．４５ μｍ）過濾，取濾液作為供試品溶液，按上述色譜條件進行含量測定，木犀草素峰面積分別為５７３．９０５、７８６．９２３、 １ ２３０．５６３、 １ ６３５．１５８、 １ ６４２．３３０，由結果可知木犀草素的峰面積隨著提取時間的增加而增加，但是當時間增加到４５ ｍｉｎ時，峰面積變化很小，故將超聲提取時間確定為４５ ｍｉｎ。

本實驗建立的總黃酮和木犀草素含量測定方法操作簡便，方法精密度高，重復性及線性關系良好，回收率較好，對于評價東北鐵線蓮的內在質量具有一定的參考意義。

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文