蛋雞白血病的PCR檢測和序列分析

摘要：采用ＰＣＲ方法對某蛋雞場送檢感染雞進行實驗室診斷，針對禽白血病病毒逆轉錄酶 ３’區域設計鑒定內外源病毒共同下游引物 Ｈ５，針對ＡＬＶ－Ｊ亞群ｇｐ８５囊膜糖蛋白基因保守區域設計上游引物Ｈ７，Ａ－Ｅ亞群ｇｐ８５囊膜糖蛋白基因保守區域設計上游引物ＡＤ１，提取肝臟病料中核酸進行 ＰＣＲ擴增，測序分析結果表明為內源性禽白血病病毒感染。

關鍵詞：禽白血病病毒（ＡＬＶ）；內源性白血病；ＰＣＲ鑒定；測序分析

中圖分類號：Ｓ８５８．３１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）14－2988-03

Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｔｙｐｅ ｏｆ Ａｖｉａｎ Ｌｅｕｃｏｓｉｓ Ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ by ＰＣＲ ａｎｄ

Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ

ＸＵ Ｑｉｎｇ－ｒｏｎｇ，ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎ－ｂａｏ，ＷＡＮＧ Ｘｉ－ｌｉａｎｇ，ＸＩＡＯ Ｙｕｎ－ｃａｉ，ＺＨＯＵ Ｚｕ－ｔａｏ，ＣＵＩ Ｗｅｉ－ｔａｏ，ＢＩ Ｄｉｎｇ－ｒｅｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕａzｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Lａｂｏｒａｔｏｕｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ on ａｆｆｅｃｔｅｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｆｒｏｍ ａ ｌａｙｅｒ ｆａｒｍ was carried out by PCR． Tｈｅ ｃｏｎｇｅｎｅｒｏｕｓ ｄｏｗｎ ｐｒｉｍｅｒ Ｈ５ was ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ３’ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ of avian leucosis virus（ALV），Ｐｒｉｍｅｒ Ｈ７ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｗｅｌｌ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｐ８５ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｊ ｓｕｂｇｒｏｕｐ； ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ＡＤ１ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｐ８５ ｏｆ Ａ－Ｅ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ． ＰＣＲ of the three pairs of primers was conducted using ｔｈｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｌｉｖｅｒ as ｓａｍｐｌｅ． Sequence analysis of PCR products ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｅ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： aｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡＬＶ）； ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｙｐｅ ｏｆ ａｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ； ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ

禽白血病是由反轉錄病毒科Ｃ型反轉錄病毒屬禽白血病／肉瘤病毒群病毒（ＡＬ／ＳＶ）所引起的禽類多種腫瘤性疾病的總稱，其感染率高，發病率低［１］。是主要以造血細胞惡性增生為特征的一類傳染病，包括淋巴細胞性白血病、成紅細胞性白血病、成髓細胞性白血病、骨髓細胞瘤病等［２］。根據病毒中和反應形式、宿主范圍、囊膜特性及其他標準將其劃分為Ａ到Ｊ １０個亞群［３］，其中Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｊ亞群見于雞。Ａ、Ｂ亞群為常見外源性病毒，主要感染商品蛋雞，可引起淋巴白血病；Ｃ、Ｄ亞群是極少報道的外源性病毒；Ｅ 亞群為普遍存在的低致病性或無致病性的內源性病毒；Ｊ亞群由Ｓｍｉｔｈｓ等［４］于１９８８年首次從商品代肉用雞中分離得到，而 Ｊ亞群是一由外源性白血病病毒與內源性Ｅ亞群病毒囊膜基因的重組體。本試驗對湖北某雞場送檢雞通過檢測進行了確定性診斷，對致病毒株進行了分子生物學亞群鑒定，現將試驗結果報道如下。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１病料試驗病料來源于湖北仙桃某蛋雞場。

１．１．２儀器與試劑Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ均購自寶生物工程（大連）有限公司（ＴａＫａＲａ）；Ｗｉｚａｒｄ?誖Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ購自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。

１．２禽白血病病原核酸鑒定

１．２．１病料總 ＤＮＡ樣本的提取取病料肝臟組織剪碎，然后與生理鹽水按１∶（５~１０）比例進行組織勻漿，８ ５００ ｒ／ｍｉｎ 離心５ ｍｉｎ，使用 Ｐｒｏｍｅｇａ公司 Ｗｉｚａｒｄ?誖Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ提取送檢血樣白細胞 ＤＮＡ，操作步驟按試劑盒說明書進行。通過 ＵＶ－２１００紫外分光光度計測定病料總 ＤＮＡ樣本的ＯＤ２６０ｎｍ和ＯＤ２８０ｎｍ值。

１．２．２引物引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。根據 ＧｅｎＢａｎｋ上的 ＡＬＶ全基因序列和已發表的參考文獻 ［４］，針對ＡＬＶ－Ｊ亞群 ｇｐ８５囊膜糖蛋白基因保守區域和逆轉錄酶３’－區域分別合成 ２對特異型引物。引物核苷酸序列資料見表１。

１．2．３ＰＣＲ擴增取病料總 ＤＮＡ ５ μＬ 作為模板，分別加入１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ｄＮＴＰ（１０ mmol/L） １ μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）３ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（２．５Ｕ）１ μＬ，上下游引物（２０ μｍｏｌ／Ｌ）各１ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ３６ μＬ，此總反應體積為５０ μＬ。Ｈ７＋Ｈ５、ＡＤ１ ＋Ｈ５兩對引物均按下列條件進行擴增：９４ ℃預變性４ ｍｉｎ， ９３ ℃變性１ ｍｉｎ，６０ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ ３０ ｓ（１３個循環，每個循環退火溫度降 １ ℃）；隨后 ９３ ℃預變性１ ｍｉｎ，４８ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ ３０ ｓ（３０個循環）；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ程序擴增完畢，取５ μＬ 擴增產物經０．８％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

１．2．４ＰＣＲ擴增產物回收與測序使用天根公司ＤＮＡ純化試劑盒回收ＰＣＲ產物，鑒定回收到產物送與南京金斯瑞生物科技有限公司測序。測序結果用ＢＬＡＳＴ軟件與ＧｅｎBａｎｋ公布的禽白血病病毒毒株相應基因進行同源性比較。

２結果與分析

２．１禽白血病病原核酸鑒定結果

采集病料肝臟組織提取的總ＤＮＡ樣本，ＤＮＡ樣本ＯＤ２６０ｎｍ / ＯＤ２８０ｎｍ比值為１．７９，含量為１．５ μｇ／ｍＬ。

２．２ＰＣＲ擴增

以ＡＤ１＋Ｈ５ 引物進行ＰＣＲ擴增，從病料肝臟組織提取的總ＤＮＡ樣本中擴增出分子長為２６３ｂｐ的ＤＮＡ帶，ｄｄＨ２Ｏ替代樣本作為陰性對照，產物大小與預期擴增長度相符（圖１）；以Ｈ７＋Ｈ５引物進行ＰＣＲ擴增，未擴增出片段，說明此病料為Ａ－Ｅ亞型禽白血病病毒感染。

２．３ＰＣＲ擴增產物測序分析

測序結果用ＢＬＡＳＴ軟件與ＧｅｎBａｎｋ上的禽白血病病毒毒株相應基因比較同源性，與內源性Ｅ亞型禽白血病病毒（ＮＣＢＩ登錄號ＦＪ７９３５５０．１）的同源性最高，為９９％，基因相似性也為９９％；與外源性Ａ（Ｍ２５３９９．１）、Ｂ（Ｍ１４９０２．１）亞型禽白血病病毒同源性分別為９９％、５４％，基因相似性分別為９６％、９７％（圖２）。此鑒定結果證實本病例是由Ｅ亞型禽白血病病毒所引起。

３討論

１）２０世紀８０年代后期，在對引起雞髓細胞性白血病Ｊ亞群禽白血病病毒深入研究的過程中，在雞的基因組中發現了內源性反轉錄病毒［５］。其中Ｅ亞群為整合在雞染色體中一種前病毒ＤＮＡ，在雞群中普遍存在［６］。外源性ＡＬＶ能誘發腫瘤，可垂直和水平傳播［７］，其中Ｃ、Ｄ亞群極為少見［８］，而內源性ＡＬＶ的致瘤性很低，不能產生感染性病毒粒子［９］。但內外源ＡＬＶ的重組將導致高致病性毒株的產生［１０］。

２）在本試驗中，參考文獻［４］，利用引物Ｈ５＋Ｈ７首先區別Ｊ亞群與Ａ－Ｅ亞群，確定為Ａ－Ｅ亞群感染，再將ＰＣＲ產物進行測序，在ＮＣＢＩ中與已有序列進行比對分析，試驗結果表明該病例為內源性禽白血病病毒感染。

３）到目前為止，該病尚無有效的治療方法和可供免疫的疫苗。由于該病的傳播途徑主要是垂直傳播，水平傳播僅占次要地位。所以，要想有效控制白血病，必須從種禽的凈化開始，通過不斷的檢測、淘汰陽性雞，建立白血病陰性的種雞群，才能從源頭上控制住商品雞白血病的發生。

參考文獻：

［１］ 喬彩霞，關云濤，陳洪巖．禽白血病研究進展［Ｊ］動物醫學進展，２００３，２４（６）：１８－２１．

［２］ 羅明星，周碧君， 史開志， 等． 血管瘤型禽白血病的實驗室診斷［Ｊ］.山地農業生物學報，２００９，２８（１）：４６－５０．

［３］ ＰＡＹＮＥ Ｌ Ｎ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｖａｉｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ［Ｊ］．Ｌｅｕｋｅｍｉａ， １９９２，６（３）：１５０－１５２．

［４］ ＳＭＩＴＨＳ Ｌ Ｍ， ＢＲＯＷＮ Ｒ， ＨＯＷＥＳ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ） ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｊ ａｖｉａｎ ｌｅｕｋｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］.Ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９８，５４：８７－９８．

［５］ ＢＥＮＳＯＮ Ｓ Ｊ，ＲＵＩＳ Ｂ Ｌ，ＦＡＤＬＹ Ａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｕｎｉｑｕｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｊ ａｖｉａｎ ｌｅｕｋｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｄｅｒｉｖｅｓ ｆｒｏｍ ｅｖ／Ｊ ｐｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，ａ ｎｏｖｅｌ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ａｖｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌ，１９９８，２：１０１５７－１０１６４．

［６］ 劉永松，潘玲．Ｊ亞群禽白血病的研究進展［Ｊ］．家禽科學，２００５ （０３）：１９９－２２１．

［７］ ＰＡＹＮＥ Ｌ Ｎ． Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｓｕｂｇｒｏｕｐ Ｊ ａｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００３，２７（６）：３６－４５．

［８］ 李新華．禽白血病的流行病學特點及防制措施［Ｊ］.養禽與禽病防治，１９９７（０４）：４４－４９．

［９］ 周剛，牛成明，司昌德，等．內源和外源性禽白血病病毒鑒別ＰＣＲ檢測方法的建立［Ｊ］． 中國預防獸醫學報，２０１０，（０７）：５４６－５４９．

［１０］ ＪＥＦＦＲＥＹ Ａ，ＷＡＬＩＤ Ｈ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅａｓｌｅｓ ａｎｄ ｍｕｍｐｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００１，７５（８）：３６０５－３６１２．

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文