棉花熱激處理和施用脫落酸的效應(yīng)

摘要：采用人工氣候箱，研究了熱激萌動種子（４２℃、２ｈ）、脫落酸（ＡＢＡ）（１×１０－５ｍｏｌ/Ｌ）浸種（６ ｈ）、２葉期葉面噴施和根部灌施，對棉苗抵御（模擬）高溫干旱逆境能力的影響。結(jié)果表明，在高溫干旱期間，與對照相比，所有處理都合成了差異蛋白質(zhì)，但ＡＢＡ浸種所合成的熱激蛋白（ＨＳＰ）更豐富。另外，所有處理都顯著提高了棉苗超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性；ＡＢＡ浸種、根部灌施處理和熱激處理還顯著提高了棉苗過氧化物酶（ＰＯＤ）活性；ＡＢＡ葉面噴施處理和熱激處理顯著提高了棉苗過氧化氫酶（ＣＡＴ）活性。ＡＢＡ葉面噴施處理和浸種處理降低了棉苗丙二醛（ＭＤＡ）含量。

關(guān)鍵詞：棉花；脫落酸；熱激；抗氧化酶

中圖分類號：Ｓ５６２；Ｑ９４５．７８文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）14－2828-03

Effect of Heat Shock and ABA Application on Cotton Seedlings

ＣＨＥＮ Ｙｕ－ｌｏｎｇ，ＣＨＥＮ Ｑｉｕ－ｚｈｕ，ＹＡＮＧ Ｇｕｏ－ｚｈｅｎｇ，ＣＨＥＮ Ｌｉａｎｇ，ＺＨＵ Ｚｈｅｎ－ｚｈｅｎ，ＳＯＮＧ Ｘｕｅ－ｚｈｅｎ，

ＷＡＮＧ Ｄｅ－ｐｅｎｇ，ＢＡＴＡＵＮＧ Ｍ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｍｂｅｒ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｏｎ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｅｄｓ （４２℃，２ｈ）， ＡＢＡ （１×１０－５ｍｏｌ/Ｌ） ｓｏａｋｉｎｇ ｓｅｅｄｓ （６ ｈ）， ｉｒｒｉｇａｔｉｎｇ ｒｏｏｔｓ （５ ｍL １×１０－５ｍｏｌ/Ｌ ＡＢＡ ｐｅｒ ｐｌａｎｔ） ａｎｄ ｓｐｒａｙｉｎｇ ｏｎ ｌｅａｆ （５ｍL １×１０－５ｍｏｌ/Ｌ ＡＢＡ ｐｅｒ ｐｌａｎｔ） ａｔ ２－ｌｅａｆ ｓｔａｇｅ ｏｎ ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｎｄｅｒ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ （３５ ℃） ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｄｅｆｉｃｉｔ （４ ｄ ｏｆ ｄｒｙｉｎｇ） ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ， ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｒｏｕｇｈｔ ｐｅｒｉｏｄ， ｃｏｔｔｏｎ ｐｌａｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ＨＳＰ， and the HSPs were more abundant ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏａｋｉｎｇ ｓｅｅｄ ｗｉｔｈ ＡＢＡ． Ａｌｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｔｈｅ ＳＯＤ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ． Ｈｅａｔ sｈｏｃｋ， ｓｏａｋｉｎｇ ｓｅｅｄ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＡＢＡ ａｌｌ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＯＤ． Ｈｅａｔ sｈｏｃｋ ａｎｄ ＡＢＡ ｌｅａｆ ｓｐｒａｙｉｎｇ ａｌｓｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＡＴ． Ｂｅｓｉｄｅｓ， ｓｏａｋｉｎｇ ｓｅｅｄ ａｎｄ ｌｅａｆ ｓｐｒａｙｉｎｇ ｗｉｔｈ ＡＢＡ ｌｏｗｅｒｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＭＤＡ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｏｔｔｏｎ； ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ （ＡＢＡ）； ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ

脫落酸（ＡＢＡ）能夠提高植物體的抗逆性。植物體內(nèi)存在一個逆境反應(yīng)系統(tǒng)，不同的逆境條件可能誘導(dǎo)不同的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，而ＡＢＡ被認為是一種重要逆境脅迫激素［1－4］。熱激蛋白（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＨＳＰ）是指生物體受到高溫、缺氧、饑餓、重金屬離子等不良環(huán)境因素影響時誘導(dǎo)合成的一類應(yīng)激蛋白，存在于胞質(zhì)溶膠、線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等不同部位。近２０多年來，已發(fā)現(xiàn)在熱激條件下，大豆、玉米、棉花、大麥、番茄、煙草、油菜和水稻等都能誘導(dǎo)合成熱激蛋白，熱應(yīng)激研究已成為植物生物工程中較為活躍而且是發(fā)展較快的領(lǐng)域之一。HSP可提高細胞的耐熱性（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ），ＨＳＰ的生成量與生物耐熱性呈正相關(guān)。因此認為，ＨＳＰ可提高細胞的應(yīng)激能力。當細胞受熱或受其他外界應(yīng)力刺激時，能獲得抗性以保護細胞免受損傷。因此，研究ＡＢＡ和熱激預(yù)處理后，在高溫干旱條件下，棉苗體內(nèi)HSP的合成及相關(guān)抗性酶活性的適應(yīng)性變化，對于探討逆境預(yù)處理的免疫效應(yīng)和提高棉苗抗逆能力，保證棉花一播全苗、打下豐產(chǎn)基礎(chǔ)具有重要的意義。

１材料與方法

１．１棉苗培養(yǎng)方法

２００５年以ＤＰ９９Ｂ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．）為試驗材料，設(shè)置１×１０－５ｍｏｌ／Ｌ ＡＢＡ浸種、三葉期葉面噴施、根部灌施、熱激和對照５個處理，三次重復(fù)。用１×１０－５ｍｏｌ／Ｌ ＡＢＡ浸種６ ｈ后播種（ＡＢＡ浸種前，用清水在２８ ℃下浸種１２ ｈ），熱激處理用４２ ℃、２ ｈ［5］處理萌動的棉花種子后播種，ＡＢＡ葉面噴施處理和ＡＢＡ根部灌施處理， 在棉苗生長到三葉期時進行。

試驗棉苗在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院中心實驗室的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為２８ ℃，日光燈提供光照，光周期為光期１４ ｈ、暗期１０ ｈ。在裝有蛭石的塑料杯（H為９ ｃｍ、Φ上為７ ｃｍ、Φ下為５ ｃｍ）中培養(yǎng)棉苗。每杯裝蛭石６０ｇ，播種后總重７８ ｇ，再澆水４０ ｍＬ。待棉苗長出后，每杯留兩株苗，每４天給培養(yǎng)苗澆水３０ ｍＬ（其中，棉苗一葉期澆完全培養(yǎng)液），各培養(yǎng)杯在托盤內(nèi)隨機擺放，以保證每個處理處于相同的培養(yǎng)條件下。

１．２可溶性蛋白質(zhì)提取

棉苗三葉期時，開始葉面噴施脫落酸（每杯１０ ｍＬ １×１０－５ｍｏｌ/Ｌ ＡＢＡ液）、根部灌施脫落酸（每杯５ ｍＬ １×１０－５ｍｏｌ/Ｌ ＡＢＡ液），然后置于高溫干旱條件下（溫度３５ ℃、４ ｄ左右不澆水）。取葉片１ ｇ，加３ ｍＬ提取液于研缽中，提取可溶性蛋白質(zhì)［6］。葉片研磨提取過程在冰浴上進行，靜置１０ ｍｉｎ，然后在４℃ １０ ０００ ｒ/ｍｉｎ條件下離心２０ ｍｉｎ，所得上清液即為蛋白質(zhì)粗提液。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳參考Ｌａｅｍｍｌｉ的垂直板進行［7］。電泳凝膠用銀染法染色，以分辨不同蛋白質(zhì)種類，銀染按Ｔｈｅ ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔTM Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ提供的方法進行。采用Ｇｅｎｅ Gｅｎｉｕｓ Bｉｏ-ｉｍａｇｉｎｇ Sｙｓｔｅｍ （Ｓｙｎｇｅｎｅ，Ａ Dｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）分析蛋白質(zhì)分子量和含量。

１．３超氧岐化酶（ＳＯＤ）活性測定

采用氮藍四唑（ＮＢＴ）測定法。０．０５ ｍｏｌ/Ｌ磷酸緩沖液（ＰＢＳ），ｐＨ值７．８作提取液，冰浴研磨，４ ℃下１０ ０００ ｒ/ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，所得的上清液即為ＳＯＤ粗提液。反應(yīng)體系包括：０．０５ ｍｏｌ/Ｌ ＰＢＳ １．５ ｍＬ，１３０ ｍｍｏｌ／Ｌ蛋氨酸（Ｍｅｔ）０．３ ｍＬ，７５０ ｍｍｏｌ/Ｌ ＮＢＴ ０．３ ｍＬ，１００ ｍｍｏｌ/Ｌ乙二胺四乙酸二鈉（ＥＤＴＡ－Ｎａ２）０．３ ｍＬ，２０ μｍｏｌ/Ｌ核黃素０．３ ｍＬ，酶液０．１ ｍＬ，去離子水０．２ ｍＬ，置于光下反應(yīng)３０ ｍｉｎ。ＳＯＤ活性以抑制ＮＢＴ光化還原的５０％為一個酶活性單位來表示［8］。

１．４過氧化氫酶（ＣＡＴ）活性測定

紫外分光光度法測定。提取方法同ＳＯＤ。其反應(yīng)體系為０．２％ Ｈ２Ｏ２ １.0 ｍL，去離子水１．９ ｍL，最后加入０．１ ｍL酶液啟動反應(yīng)，測定２４０ ｎｍ處的A值降低程度。將每分鐘A值減少０．０１定義為１個酶活性單位［9］。

１．５過氧化物酶（ＰＯＤ）活性測定

愈創(chuàng)木酚法測定。酶液的提取同ＳＯＤ的提取方法。其反應(yīng)體系為０．２％ Ｈ２Ｏ２ ２．００ ｍＬ，０．２％愈創(chuàng)木酚０．９５ ｍＬ，ＰＢＳ（ｐＨ值７．０）１．００ ｍＬ，最后加入０．０５ ｍＬ酶液啟動反應(yīng)，記錄A值增加的速度［8］。

１．６丙二醛（ＭＤＡ）含量測定

硫代巴比妥（ＴＢＡ）法測定。以５０ ｍｍｏｌ/Ｌ磷酸緩沖液（ＰＢＳ，ｐＨ值７．０）在冰浴中提取，４ ℃時以

１０ ０００ ｒ/ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，上清液即為丙二醛粗提液。反應(yīng)體系包括０．５％硫代巴比妥（ＴＢＡ）２．５ｍＬ，酶液１．５ ｍＬ，混合后在沸水浴中煮１５ ｍｉｎ，冷卻后，分別測定酶液在４５０、５３２和６００ ｎｍ處的吸光度，按公式Ｃ（μｍｏｌ／Ｌ）＝６．４５×（Ａ５３２－Ａ６００）－０．５６×Ａ４５０計算出ＭＤＡ濃度，再計算出單位鮮重組織中ＭＤＡ含量（μｍｏｌ/ｇ）［8］。

１．７數(shù)據(jù)分析

采用Ｅｘｃｅｌ ２００３作差異顯著性檢驗（ＬＳＤ法）

２結(jié)果與分析

２．１棉苗HSP表達

從凝膠泳道上可以清楚地看出，與對照相比（泳道１０、１１），所有處理都合成了非常豐富的ＨＳＰ，尤其以小分子量ＨＳＰ為主（圖１）。

采用凝膠自動成像系統(tǒng)掃描分析。結(jié)果（表１）表明， ＡＢＡ根部灌施處理檢測到１１種蛋白質(zhì)，其中６種ＨＳＰ，關(guān)閉了１種蛋白質(zhì)的合成；ＡＢＡ浸種處理也合成了１１種蛋白質(zhì)，其中９種ＨＳＰ，關(guān)閉了４種蛋白質(zhì)的合成；熱激處理合成了７種蛋白質(zhì)，其中４種HSP，關(guān)閉了３種蛋白質(zhì)的合成；ＡＢＡ葉面噴施處理檢測出５種蛋白質(zhì)，其中２種ＨＳＰ，同時關(guān)閉了３種蛋白質(zhì)的合成。對照中８７ｋＤ在所有處理中都沒有得到表達，說明其與棉苗正常生長發(fā)育關(guān)系不大；而３０ｋＤ在所有處理中得到了表達，說明其是組成型表達的，與棉苗正常生長發(fā)育相關(guān)。ＡＢＡ根部灌施處理保留了６種蛋白質(zhì)的合成，浸種處理保留了２種，葉面噴施處理和熱激處理都保留了３種蛋白質(zhì)。表明不同預(yù)處理后，棉苗對次生逆境的反應(yīng)機制存在一定差異。ＡＢＡ根部灌施處理和浸種處理不但表達了熱激處理中所表達的熱激蛋白，并且還表達了熱激處理中所沒有的大分子量蛋白質(zhì)（＞１００ｋＤ）和中等分子量蛋白質(zhì)（４０～１００ｋＤ）。

從各處理蛋白質(zhì)的合成量來說，所有對照中合成的蛋白質(zhì)的合成都受到了不同程度的抑制（除熱激處理的１５ｋＤ之外），其中對１７ｋＤ的抑制最強。ＨＳＰ合成量超過１ μｇ／ｇ的有５種，其中含量最高的是ＡＢＡ浸種處理的ＨＳＰ１４ｋＤ，其含量達到４．２４ μｇ／ｇ，其次是ＡＢＡ葉面噴施處理的ＨＳＰ２１ ｋＤ，達到２．３１ μｇ／ｇ，熱激處理的ＨＳＰ１４ｋＤ，含量為１．４６ μｇ／ｇ。

２．２不同預(yù)處理抗氧化酶活性和MDA含量

生物體內(nèi)抗氧化酶活性可以反映其抵御逆境的能力，而ＭＤＡ含量可以間接反映生物體遭受逆境破壞的程度。經(jīng)受不同形式的逆境預(yù)處理之后，棉花幼苗在次生逆境條件下，其體內(nèi)ＳＯＤ活性，熱激處理極顯著高于對照，其他處理顯著高于對照；ＣＡＴ活性，ＡＢＡ葉面噴施處理極顯著高于對照，熱激處理顯著高于對照，其他處理與對照相當；ＰＯＤ活性，除ＡＢＡ葉面噴施處理與對照相當外，其余處理均顯著高于對照；ＭＤＡ含量，ＡＢＡ葉面噴施處理和浸種處理顯著低于對照，其余處理與對照相當（表２）。說明亞致死逆境預(yù)處理能提高棉苗抗次生逆境的能力。

３小結(jié)與討論

ＡＢＡ根部灌施處理、浸種處理和熱激處理的棉苗在高溫干旱條件下，能夠表達比對照更多種類的ＨＳＰ。由此可見逆境預(yù)處理能夠誘導(dǎo)棉苗ＨＳＰ基因的表達。分析測定棉苗在高溫干旱條件下葉片內(nèi)的抗氧化酶活性和ＭＤＡ含量表明，這些被誘導(dǎo)的ＨＳP基因的表達與棉苗在高溫干旱條件下的抗性有關(guān)。不同處理，棉苗合成的ＨＳＰ種類和數(shù)量不同，其中ＡＢＡ浸種處理表達了９種ＨＳＰ，特別是小分子量的ＨＳＰ，而且其ＨＳＰ的量最大。熱激處理顯著或極顯著提高了３種抗氧化酶活性，ＡＢＡ處理（浸種、根部灌施和葉面噴施）都顯著提高了至少２種抗氧化酶活性。因此，各處理ＭＤＡ含量顯著低于對照或與對照相當。說明逆境鍛煉有助于棉苗獲得一定的抗逆能力，其機制是通過啟動ＨＳＰ基因的表達，提高抗氧化酶活性，保護細胞免受傷害。

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文