水稻類受體激酶CRIＮKLY4胞外結(jié)合蛋白的研究

摘要：水稻類受體激酶ＣＲＩＮＫＬＹ４參與了植物細胞的增殖和分化。為了尋找ＣＲＩＮＫＬＹ４的胞外結(jié)合蛋白，采用了水稻ＣＲＩＮＫＬＹ４的胞外域作為誘餌蛋白，酵母雙雜交篩選兩周的小苗ｃＤＮＡ文庫。結(jié)果得到許多靶標蛋白，其中一個水通道蛋白質(zhì)值得關(guān)注。

關(guān)鍵詞：水稻；類受體激酶；酵母雙雜交

中圖分類號：Ｑ２９１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）14－2982-03

Study on Extracellular Binding Proteins of CRINKLY4 in Rice

ＹＡＯ Ｑｉｎｇ－ｇｕｏ，ＬＩ Ｘｉａｏ－ｑｉｎ，ＺＨＯＵ Ｅｒ－ｐｅｎｇ，ＷＡＮＧ Ｊｕａｎ，ＦＥＮＧ Ｊｕｎ－ｘｉａ

（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００３５，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＣＲＩＮＫＬＹ４ ｗａｓ ａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｐｌａｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ａ ｗｉｄｅ ａｒｒａｙ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｔｏ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＣＲＩＮＫＬＹ４， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＣＲＩＮＫＬＹ４ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｂａｉｔ ｉｎ ａ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｗｅｅｋｓ ｏｌｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ． Ｎｕｍｅｒｏｕｓ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａ ｎｏｔａｂｌｅ ｉｎｔｒｕｓｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｉｃｅ； ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ； ｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ

ＣＲＩＮＫＬＹ４屬于腫瘤壞死因子類受體激酶，是最早在玉米中被發(fā)現(xiàn)的，后來在擬南芥和水稻中發(fā)現(xiàn)其同源的蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為ＣＲＩＮＫＬＹ４蛋白質(zhì)家族［１］。ＣＲＩＮＫＬＹ４蛋白質(zhì)家族類受體激酶在玉米葉片和側(cè)根發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用［２］。存在于質(zhì)膜上的ＣＲＩＮＫＬＹ４可能接受胞外某種發(fā)育的信號，決定細胞分化的命運，到目前為止，ＣＲＩＮＫＬＹ４蛋白質(zhì)家族類受體激酶在植物中的功能研究已經(jīng)相當深入，但對于它的信號通路知之較少。以水稻ＣＲＩＮＫＬＹ４的胞外域為誘餌，通過酵母雙雜交，試圖篩到與水稻ＣＲＩＮＫＬＹ４胞外域相互作用的蛋白質(zhì)。

１材料與方法

１．１材料

水稻品種為日本晴，水稻小苗種植在溫室中（１４ ｈ光照，１０ ｈ黑暗，２８ ℃左右），建文庫所提取的ＲＮＡ來自生長兩周的水稻小苗葉片。酵母菌株ＡＨ１０９購自美國Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。所用培養(yǎng)基均按照《分子克隆實驗指南》第三版配制，滅菌后按比例加入所需抗生素。

１．２方法

１．２．１文庫的構(gòu)建和篩選采用美國Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司酵母雙雜交試劑盒構(gòu)建和篩選酵母雙雜交文庫，按照其酵母雙雜交系統(tǒng)操作手冊進行。ＣＲＩＮＫＬＹ４由９０１個氨基酸殘基組成，編碼區(qū)全長２ ７０６ｂｐ，ＳｉｇｎａｌＰ ３．０分析信號肽斷裂位點位于Ｎ－端２２位甘氨酸和２３位亮氨酸之間；ＴＭＨＭＭ ２．０分析跨膜域位于Ｎ－端４２４到４４６位氨基酸，選取Ｎ－端２４到４２１位氨基酸的核苷酸序列構(gòu)建到篩庫的ＢＤ誘餌載體上形成ｐＧＢＫＴ７－ＣＲＩＮＫＬＹ４。擴增水稻ＣＲＩＮＫＬＹ４胞外域的引物，Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ為Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ，Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ為Ｇ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ａ Ｃ，測序正確的質(zhì)粒進行后續(xù)的篩庫實驗。

１．２．２生物信息學分析氨基酸序列比對采用ＢｌａｓｔＰ；信號肽分析用ＳｉｇｎａｌＰ ３．０；跨膜域分析采用ＴＭＨＭＭ ２．０。

２結(jié)果與分析

２．１酵母雙雜交篩選陽性克隆

將文庫ｃＤＮＡ樣品、ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ和ｐＧＢＫＴ７－ＣＲＩＮＫＬＹ４共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，搖培后將共轉(zhuǎn)化混合物（約６ ｍＬ）涂在四缺培養(yǎng)基上（直徑１５ ｃｍ平板約涂１５０ μＬ左右菌液）；３０ ℃恒溫培養(yǎng)，２～３ ｄ后，可見一些克隆，平板繼續(xù)培養(yǎng)８ ｄ，使生長較慢的克隆出現(xiàn)（圖１ａ）。篩庫共有１１６個克隆長出，將這些克隆劃線到新的四缺培養(yǎng)基上（圖１ｂ），連續(xù)劃線４次以上，在此過程中有許多克隆不再生長，推測為假陽性克隆，將仍能夠在四缺培養(yǎng)基上生長的陽性克隆，進行后續(xù)β－半乳糖苷酶活性（β－Ｇａｌ）檢測（圖１ｃ），顯較深的藍色的有８７個，還有顏色較淺甚至不顯色但在四缺培養(yǎng)基上生長的，推測顯色比較弱的克隆可能存在著比較弱的相互作用。

提取β－Ｇａｌ檢測為陽性的８７個酵母克隆的質(zhì)粒，通過電擊法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，在含有氨芐青霉素（Ａｍｐ）的抗性平板上篩選，從單克隆大腸桿菌中提取質(zhì)粒，用Ｂａｍ ＨⅠ和Ｅｃｏ ＲⅠ雙酶切鑒定陽性克隆質(zhì)粒，陽性克隆質(zhì)粒與質(zhì)粒ｐＧＢＫＴ７－ＣＲＩＮＫＬＹ４一對一共轉(zhuǎn)化酵母，篩選出在四缺培養(yǎng)基上仍生長且β－Ｇａｌ檢測為陽性的克隆總共６４個，將克隆對應(yīng)質(zhì)粒中外源片段進行測序，引物為Ｔ７，測序得到非重復(fù)的１９個核苷酸序列，將與ｐＧＡＤＴ７－Ｒｅｃ閱讀框融合的氨基酸序列，輸入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行搜索，得到的結(jié)果如表１。

２．２ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６的相互作用的驗證

為了驗證ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６（Ｐｌａｓｍａ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＩＰ）之間的相互作用，采用泛素系統(tǒng)進行了驗證。圖２中ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６分別轉(zhuǎn)化酵母后在一缺培養(yǎng)基上生長，在二缺培養(yǎng)基上雜交，在四缺培養(yǎng)基上劃線生長，挑菌落在濾紙上進行β－Ｇａｌ染色。通過圖２和表２可以看出，在泛素體內(nèi)試驗中，ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６單獨都沒有自激酶活性，ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６共同轉(zhuǎn)化酵母，可以在四缺培養(yǎng)基上生長，同時β－Ｇａｌ染色顯示藍色，更進一步說明在泛素系統(tǒng)的體內(nèi)實驗中ＣＲＩＮＫＬＹ４和ＯｓＰＩＰ２－６可以相互作用。

３討論

３．１通過酵母雙雜交篩選與ＣＲＩＮＫＬＹ４胞外域相互作用的蛋白質(zhì)

通過序列比對發(fā)現(xiàn)，水稻中的ＣＲＩＮＫＬＹ４與玉米中的ＺｍＣＲ４高度同源（８７％）［２］，ＺｍＣＲ４參與了玉米葉片表皮細胞的分化和種子糊粉層的形成過程［１］，而且前期的工作也表明，ＣＲＩＮＫＬＹ４基因的ＲＮＡｉ植株葉片卷曲而且結(jié)實率下降，推測ＣＲＩＮＫＬＹ４在水稻中可能發(fā)揮與ＺｍＣＲ４相似的生物功能。

ＣＲＩＮＫＬＹ４胞外具有ＴＮＦ受體的結(jié)構(gòu)域和７個卷曲重復(fù)結(jié)構(gòu)，屬于水稻質(zhì)膜上的ＴＮＦ型的受體激酶［４］。在動物中，腫瘤壞死因子通過與質(zhì)膜上的受體結(jié)合而傳遞細胞死亡的信號，因此推測ＣＲＩＮＫＬＹ４很可能與胞外的多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮功能，胞外的ＴＮＦ受體樣結(jié)構(gòu)可能是與胞外多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域［１］。近期的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中與ＣＲＩＮＫＬＹ４同源的蛋白質(zhì)ＡＣＲ４胞外的７個卷曲重復(fù)序列與ＡＣＲ４功能的行使密切相關(guān)，缺失卷曲重復(fù)序列的ＡＣＲ４突變體恢復(fù)株系中，不會恢復(fù)突變體的表型［４］。ＡＣＲ４中氨基酸的突變使形成二聚體的可能性增加很多，ＺｍＣＲ４和ＡＣＲ４的跨膜域在體內(nèi)都可形成同源二聚體而發(fā)揮其生理功能［２］。２０１０年Ｓｔｏｋｅｓ［５］更加詳細地突變ＣＲＩＮＫＬＹ４和

ＡＣＲ４跨膜域的氨基酸，發(fā)現(xiàn)ＣＲＩＮＫＬＹ４跨膜域的前１２個氨基酸對二聚體的形成至關(guān)重要。推測ＣＲＩＮＫＬＹ４可能與胞外的多肽、蛋白質(zhì)相互作用來進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此采用ＣＲＩＮＫＬＹ４的胞外域為誘餌，篩選水稻的小苗的ｃＤＮＡ文庫，試圖尋找胞外的與之相互作用的多肽、蛋白質(zhì)。

篩庫得到的陽性克隆進行測序發(fā)現(xiàn)插入到ＡＤ質(zhì)粒的部分往往不是基因的全長［７］。在篩庫后進行ＡＤ質(zhì)粒測序發(fā)現(xiàn)，插入到ＡＤ質(zhì)粒的大部分為基因３’端的部分，推測可能是由于在反轉(zhuǎn)錄前純化ＲＮＡ的步驟比較多導(dǎo)致ｍＲＮＡ的斷裂，只有從３’末端斷裂的ｍＲＮＡ片端有PｏｌｙＡ的結(jié)構(gòu)，而采用的反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈所用引物的序列為５’－ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣ

ＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ ｄ（Ｔ）３０－３’，引物除含有同源重組位點外還含有３０個Ｔ的序列，反轉(zhuǎn)錄時引物所結(jié)合的位置為ｍＲＮＡ的３’末端的多聚Ａ，因此只有含多聚Ａ的從３’末端斷裂的ｍＲＮＡ才能和引物結(jié)合，而得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在酵母體內(nèi)同源重組到ＡＤ中，由此可見，在文庫構(gòu)建中優(yōu)化ｍＲＮＡ的純化條件、保持ｍＲＮＡ的完整性是保證庫容量的關(guān)鍵。

３．２ＣＲＩＮＫＬＹ４與ＯｓＰＩＰ２－６的關(guān)系

長期以來，普遍認為細胞內(nèi)外的水分子是以簡單擴散的方式透過脂雙層膜的。ＣＨＩＰ２８是從血紅細胞中克隆的第一個水通道蛋白質(zhì)［６］。其后科學家陸續(xù)從哺乳動物、植物、微生物中鑒定出各種水通道蛋白質(zhì)。植物水通道蛋白質(zhì)控制木質(zhì)部液流在葉肉中的卸載，決定木質(zhì)部液流和蒸騰流的通路，因此水通道蛋白質(zhì)參與了細胞間的快速跨膜運輸、細胞的生長分化和逆境脅迫等許多生理過程［７，８］。ＣＲＩＮＫＬＹ４是細胞質(zhì)膜上的一個受體激酶，ＣＲＩＮＫＬＹ４家族類受體激酶在玉米、擬南芥和水稻的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，推測存在于質(zhì)膜上的ＣＲＩＮＫＬＹ４可能接受胞外某種環(huán)境的信號，跨膜信號轉(zhuǎn)換傳遞給水通道蛋白質(zhì)ＯｓＰＩＰ２－６，從而引起細胞的一系列生理反應(yīng)，影響植物的生長發(fā)育。

通過酵母雙雜交篩庫方法篩選到與ＣＲＩＮＫＬＹ４胞外域相互作用的一系列蛋白質(zhì)，其中水通道蛋白質(zhì)ＯｓＰＩＰ２－６是比較引起關(guān)注的，它們的亞細胞定位以及在生物體內(nèi)是否與ＣＲＩＮＫＬＹ４的胞外域真正相互作用，是下一步研究要解決的問題。

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注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文