D5囊胚解凍后培養時間對妊娠結局的影響

劉軍霞，熊順，韓偉，武麗紅，黃國寧

(重慶市婦幼保健院生殖醫學中心，人類胚胎工程重慶市重點實驗室，重慶 400013)

囊胚移植提高了種植率、妊娠率及活產率，同時降低了流產率[1-2]。隨著玻璃化冷凍的普及以及囊胚培養的優化，玻璃化冷凍囊胚開始廣泛應用，國內外許多中心開展了玻璃化凍融囊胚移植。由于每個生殖中心工作模式的不同，囊胚解凍的時間也不同。有的是提前解凍過夜培養后移植，有的是解凍后當天移植。囊胚解凍后體外培養時間對移植結局的影響尚存在爭議，有報道認為解凍后培養時間對囊胚移植結局無影響[2-3]，有報道則認為解凍后培養時間對囊胚的移植結局有影響[4-7]。鑒于此，本研究對我中心的D5凍融囊胚移植周期數據進行回顧性分析，分析囊胚解凍后培養時間對妊娠結局的影響，期望可以優化囊胚解凍移植策略，更好的指導臨床工作。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析我中心2018年7月至2019年12月行凍融囊胚移植的病例資料。

納入標準：年齡小于38歲；復蘇周期采用人工周期準備內膜；凍融的囊胚為D5的4期優質囊胚。排除標準：子宮內膜異位癥及子宮腺肌癥；內膜<8 mm；移植次數>2次的患者。

共納入1 571個周期。根據解凍后培養時間分為A組(培養2～4 h)和B組(過夜培養16～20 h)。考慮到移植囊胚數目對妊娠結局的影響，根據移植囊胚數目進一步將以上兩組再各分為兩個亞組：移植2枚囊胚的A2組(n=459)和B2組(n=658)；移植1枚囊胚的A1組(n=218)和B1組(n=236)。

二、研究方法

1.囊胚培養及評分：本研究納入的患者在新鮮周期中所采用的超促排卵方案按照本中心常規進行，受精方式采用常規IVF或ICSI授精。胚胎培養使用G5序貫培養液(Vitrolife，瑞典)，置于37℃、6% CO2、5% O2培養箱培養。囊胚培養使用G2培養液(Vitrolife，瑞典)，第5天和第6天分別觀察囊胚形成情況。囊胚評分參考Gardner評分系統。本實驗室將內細胞團與滋養外胚層的評分為BB及以上的囊胚定義為優質囊胚。因囊胚發育階段及質量會對妊娠結局產生重要的影響，故本研究納入的冷凍囊胚標準為第5天形成的評級在BB級及以上的4期優質囊胚。

2.囊胚冷凍及復蘇：采用玻璃化冷凍/復蘇試劑盒(Kitazato，日本)。囊胚冷凍之前均使用激光打孔進行人工皺縮。冷凍前在室溫下(24～ 25℃)平衡30 min；將囊胚在ES液中平衡10 min，再移入VS液中洗滌約60 s，迅速將囊胚置于開放式冷凍載桿(Cryotop，日本)上，立即投入液氮。囊胚復蘇操作前，將TS液于37℃條件下平衡1 h，DS、WS1、WS2液均于室溫下(24～25℃)平衡30 min；將裝載冷凍囊胚載桿從液氮罐中取出，迅速放入TS液中1 min，使囊胚脫落，然后將囊胚依次置于DS液3 min，WS1、WS2液中各5 min。解凍后的囊胚行激光輔助孵化。過夜培養16～20 h或培養2～4 h后進行移植。

3.子宮內膜的準備與囊胚移植：于月經周期第2～4天開始口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜爾，德國)4～10 mg/d，14 d后再次B超檢查子宮內膜厚度，當內膜厚度≥7 mm時，加用黃體酮(雪諾同，默克雪蘭諾，德國)90 mg，黃體酮轉化的第6天行囊胚移植。

4.移植后妊娠判定及觀察指標：移植后14 d 測血β-HCG值。移植后4～6周，B超檢查見宮內或宮外孕囊定義為臨床妊娠，孕囊數即著床個數。

觀察指標：著床率=孕囊數/移植胚胎數×100%(單胚胎移植孕囊數僅計為1)；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；早期流產率=孕12周內自然流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；繼續妊娠率=繼續妊娠周期數/移植周期數×100%；多胎率=多胎妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、患者基礎情況比較

本研究納入1 571個D5囊胚凍融移植周期。患者的年齡范圍為20～37 歲。患者的年齡、不孕年限、體重指數(BMI)、基礎性激素水平、內膜厚度及原發不孕的比例在雙囊胚移植周期(A2組 vs. B2組)、單囊胚移植周期(A1組 vs. B1組)比較均無統計學差異(P>0.05)(表1，表2)。

表1 雙囊胚移植患者的一般情況比較[(-±s)，n(%)]

表2 單囊胚移植患者的一般情況比較[(-±s)，n(%)]

二、各組的臨床結局比較

A2和B2及A1和B1組間囊胚復蘇率無統計學差異(P>0.05)；A2組的種植率、臨床妊娠率、繼續妊娠率和多胎率顯著高于B2組(P<0.05)，而流產率顯著低于B2組(P<0.05)；A1組的種植率、臨床妊娠率和繼續妊娠率顯著高于B1組(P<0.05)，A1組的流產率有降低的趨勢，但無統計學差異(P>0.05)(表3，表4)。

表3 雙囊胚移植的臨床結局比較(%)

表4 單囊胚移植的臨床結局比較(%)

三、Logistic回歸分析

Logistic回歸分析顯示，囊胚解凍后是否過夜培養及移植囊胚數與妊娠率有顯著相關性(P<0.05)，過夜培養與妊娠率呈負相關，移植囊胚數與妊娠率呈正相關；其它因素與妊娠率無顯著性相關性(P>0.05)(表5)。囊胚解凍后是否過夜培養與流產率有顯著相關性(P<0.05)，過夜培養與流產率呈正相關；其它因素與流產率無顯著性相關性(P>0.05)(表6)。

表5 臨床妊娠率影響因素的Logistic回歸分析

表6 流產率影響因素的Logistic回歸分析

討 論

凍融囊胚移植的妊娠結局跟囊胚的發育速度及囊胚質量密切相關[8-10]，考慮到囊胚發育速度及質量對妊娠結局的影響，本研究納入的囊胚均為D5冷凍的4期優質囊胚。各組患者的一般情況在移植雙囊胚組間及移植單囊胚組間均無統計學差異，各組間的復蘇率也無統計學差異(P>0.05)。

本研究的Logistic回歸分析顯示：囊胚解凍后是否過夜培養及移植囊胚數與臨床妊娠率有顯著相關性(P<0.05)，過夜培養與妊娠率呈負相關，移植囊胚數與妊娠率呈正相關；囊胚解凍后是否過夜培養與流產率有顯著相關性(P<0.05)，過夜培養與流產率呈正相關。研究結果顯示，囊胚解凍后培養時間2～4 h組移植的臨床妊娠率、種植率及繼續妊娠率顯著高于培養16～20 h組，而流產率低于16～20 h組，改善了妊娠結局。

Fang等[2]研究顯示囊胚解凍后過夜培養和當天解凍培養2～3 h的臨床妊娠率、種植率及繼續妊娠率無統計學差異(P>0.05)。周靜等[6]的研究顯示解凍后過夜培養16～18 h與解凍培養2～4 h的妊娠率及種植率無統計學差異(P>0.05)。本研究結果與這些研究結果不同，可能是因為文獻中的囊胚不是選擇的D5優質囊胚，沒有平衡囊胚的發育速度及質量，而且文獻中內膜準備方案也與本研究不同，這些可能造成了與本研究結果的差異。還有一些關于囊胚解凍后體外培養時間對妊娠結局影響的研究，是對比了當天解凍后不同培養時間對妊娠結局的影響。如陶林林等[5]的報道顯示囊胚解凍后培養2～5 h比≤2 h提高了臨床妊娠率。邱乒乒等[4]的研究顯示囊胚解凍后培養4～8 h較培養2～4 h改善了臨床結局。這些結果顯示延長囊胚解凍后培養時間改善了臨床結局，可能是適當延長培養時間后淘汰了發育差的囊胚，選擇出更有活力的囊胚[11]。同時由于解凍與移植仍然在同一天進行，并未影響到囊胚與內膜的同步性。但是本研究中囊胚提前解凍過夜培養16～20 h移植，體外培養時間較長，增加了囊胚損傷的可能性[12]，同時囊胚經過過夜培養后與內膜的同步性是否受到影響還尚未可知。這些原因可能造成本研究結果與上述兩個當天解凍后移植的研究結果不同。本研究中雙囊胚移植周期中解凍后2～4 h組的流產率顯著低于過夜培養組，單囊胚移植的流產率組間無統計學差異，但是有降低趨勢。有報道顯示囊胚解凍后過夜培養比培養2～4 h移植的流產率增加[6-7]，本研究結果與其一致。有文獻報道D6囊胚在體外延長1 d培養，促凋亡基因BAX表達增加，增加了細胞凋亡的發生率[13]。過夜培養可能會增加囊胚損傷的可能性[12]，從而增加流產率。結果提示囊胚解凍后體外培養時間不宜過長，以免影響妊娠結局。

本研究中解凍后培養2～4 h移植，雙囊胚移植組的多胎率顯著高于16～20 h組(54.96% vs.39.48%，P<0.05)，單囊胚移植組的多胎率均低于2%，與文獻報道的數據一致，單囊胚移植明顯降低了多胎率[14-16]。因此在臨床工作中，考慮到多胎對母親和胎兒的影響，應該盡量降低多胎率，推薦單囊胚移植。

D5囊胚當天解凍培養2～4 h移植的優勢：D5囊胚解凍后培養2～4 h移植，減少了體外培養時間，降低了囊胚損傷的可能性[12]；D5囊胚復蘇后培養2～4 h移植與內膜的同步性較好，從而提高了妊娠率及著床率，降低了流產率。另外有文獻報道在移植整倍體囊胚中，D5囊胚的種植率和活產率較高[9]。2019年的一篇薈萃分析對D5和D6的冷凍囊胚移植妊娠率及出生率進行分析，D5的囊胚妊娠率和出生率高于D6的囊胚[17]。這些研究也顯示了D5囊胚移植的優勢，提示應該避免將D5囊胚解凍后過夜培養成為D6的囊胚再進行移植。

本研究中Logistic回歸分析顯示：囊胚移植數與臨床妊娠率有顯著相關性(P<0.05)，且與妊娠率呈正相關。本研究對移植囊胚數進行匹配，使結果更加客觀準確；納入的數據為D5的4期優質囊胚，排除了囊胚發育速度及質量對妊娠結局的影響；均采用人工周期準備內膜，排除方案對種植窗的影響；而且排除了高齡、反復種植失敗及本身有內膜因素的患者。通過這些納入條件的限制，減少了各種混雜因素的干擾，使結果更加客觀。由于本研究是回顧性研究，研究結果仍可能會存在一定的偏倚，需要大樣本前瞻性對照研究來進一步驗證。研究只對人工周期內膜準備方案的患者進行分析，所以不一定適用于其它內膜準備方案的患者。

綜上所述，D5冷凍囊胚解凍后培養2～4 h移植比培養16～20 h移植的妊娠結局更好，建議解凍后培養時間不宜過長，盡可能合理安排囊胚解凍時間，改善患者的妊娠結局。