植物DNA提取方法研究進(jìn)展

　　摘 要： 本文主要介紹了近年來國內(nèi)外幾種常用的DNA提取方法：CTAB法、SDS法，并在對其進(jìn)行了簡單的歸納總結(jié)與比較分析同時，介紹了一些新的改良方法和其他植物提取方法。
　　關(guān)鍵詞： 植物DNA 提取方法 研究進(jìn)展
　　
　　植物DNA的制備是分子生物學(xué)對各類植物進(jìn)行更深入一步研究的基礎(chǔ)，所制備出的DNA質(zhì)量的好壞將直接關(guān)系到后期分子生物學(xué)試驗(yàn)研究的成敗。目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)并使用的DNA提取方法有很多，其中被最為廣泛應(yīng)用的DNA提取方法是傳統(tǒng)的CTAB法和SDS法。由于不同植物的材料組分各異，因此對不同植物DNA的提取存在著不同的效果。目前許多學(xué)者都在致力于研究不同的植物DNA提取方法。他們在探索新方法的同時，也針對不同的植物，在傳統(tǒng)的提取方法上進(jìn)行著一些新的改良。
　　1.十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）法
　　在目前眾多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最為廣泛應(yīng)用的一種。它既可以裂解細(xì)胞，又可以有效地去除多酚類和多糖類物質(zhì)的沉淀，因而經(jīng)常被應(yīng)用于植物的DNA提取工作中。
　　1.1原理及方法
　　CTAB是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜。同時它能與核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可解離的，從而可使DNA和多糖物質(zhì)分開。當(dāng)溶液鹽濃度降低到一定程度（0.3mol/L NaCl）時，這些復(fù)合物將會從溶液中形成沉淀，隨后通過離心技術(shù)就可將CTAB-核酸的復(fù)合物與蛋白類、多糖類物質(zhì)分開。而對于富含多酚、多糖物質(zhì)的植物組織，則通過增加提取緩沖液中β-巰基乙醇的用量，便可有效地控制酚類物質(zhì)的氧化褐變及DNA的降解，用氯仿/異戊醇來沉淀蛋白質(zhì)，從而提高產(chǎn)物的純度。最后用乙醇來沉淀DNA，除去CTAB。
　　1.2適用范圍及一些改良
　　由于CTAB提取法能夠有效地去除多糖及酚類物質(zhì)的沉淀，因而適用于從含酚類及糖類物質(zhì)較高的植物材料中提取DNA。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)CTAB提取法在落羽杉屬樹木、黑木相思、野生稻、野燕麥、枸杞、花生的DNA的提取中，相比較其他提取方法來說都是最好的提取方法。
　　為了縮短提取流程，提高提取質(zhì)量，研究人員在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，針對不同植物的特點(diǎn)，對一些提取步驟進(jìn)行了改進(jìn)。李先進(jìn)［１］在對四種藥用蕨類DNA提取的比較研究中發(fā)現(xiàn)，由于酚類物質(zhì)極其容易被氧化，因此可以在最開始研磨材料的時候加入4%PVP，以防止研磨中細(xì)胞組織破裂后酚的氧化，從而獲得更為理想的DNA。黃永蓮［2］首先將材料在4℃放置1—2天，以便于其葉片中的多糖類物質(zhì)的降解；然后在用CTAB處理的同時加入蛋白酶K，提高提取緩沖液中β-巰基乙醇用量，增加氯仿/異戊醇的量和使用次數(shù)，以及縮短異丙醇沉淀DNA的時間。用此改良的CTAB法提取菠菜和榕樹葉片DNA，獲得了良好的效果。袁燕［3］對蒜頭果基因組進(jìn)行DNA提純的研究中發(fā)現(xiàn)，EDTA的濃度在20—30mmol/L時，提取DNA的效果較好，同時在提取的過程中，往研缽中加入少量PVP和VitC固體與蒜頭果種仁共同研磨，不僅能阻止多糖、多酚氧化物等與DNA的結(jié)合和反應(yīng)，而且能除去大部分油脂和雜質(zhì)，可以大大提高DNA的純度。
　　2.十二烷基磺酸鈉（SDS）法
　　SDS提取法與CTAB提取法一樣，也為常用的DNA提取方法。在DNA的提取過程中，有機(jī)溶劑的抽提效果及裂解液的裂解效果都是影響有機(jī)物質(zhì)去除的先決條件，不同的有機(jī)溶劑和裂解液對于不同種類的植物DNA提取作用也有所差異。所以有很多植物比較適合使用SDS提取法對其進(jìn)行DNA的提取。
　　2.1原理及方法
　　SDS是一種陰離子去污劑，它能夠裂解細(xì)胞。使用氯仿等有機(jī)溶劑抽提蛋白質(zhì)和糖類，并且用乙醇或異丙醇來沉淀DNA。SDS提取法提取流程和CTAB提取法一樣。
　　2.2適用范圍及一些改良
　　在對老芒麥的基因組DNA分離的研究試驗(yàn)中，李景環(huán)［１0］發(fā)現(xiàn)，SDS提取法是一種快速、簡便、有效的基因組DNA小量提取法。另外，在一些研究中還發(fā)現(xiàn)，SDS提取法能替代操作過程較煩瑣的大量法提取基因組DNA，從而給研究工作帶來便利。
　　在毛白楊成熟葉片基因組DNA提取的研究中李繼東［4］通過比較發(fā)現(xiàn)，SDS提取法是提取出質(zhì)量高純度高的毛白楊成熟葉片DNA的最佳方法，同時發(fā)現(xiàn)，如果將PVP添加到裂解液中，可以大大減少了試驗(yàn)的操作步驟，提取效果同樣很好。另外也有研究發(fā)現(xiàn)，SDS高鹽介質(zhì)法又較常規(guī)SDS法省去了添加液氮研磨和水浴加熱抽提等操作，可使得DNA提取試驗(yàn)的操作變得簡便快速。
　　3.高鹽低pH法
　　運(yùn)用高鹽低pH提取法對植物的DNA進(jìn)行提取也較為普遍，此方法所用的試劑僅有無機(jī)鹽和異丙醇，而醋酸鉀又是常用的無機(jī)鹽試劑。由于高鹽低pH提取法沒有反復(fù)抽提的過程，其所需要的試驗(yàn)材料也較少，因此比較適合應(yīng)用于瀕臨滅絕的瀕危物種植物的DNA提取。
　　郝朝運(yùn)［5］在對忍冬科部分植物DNA提取方法的研究中發(fā)現(xiàn)，用高鹽低pH法能有效地防止組織破碎及沉淀時的電離化作用和酚類化合物的進(jìn)一步氧化，避免了采用酚、氯仿等有毒試劑，同時低pH的醋酸鉀溶液也是有效的蛋白質(zhì)沉淀劑。在高鹽提取緩沖液中加入一定量的β-巰基乙醇，則可有效去除木本植物中含量較多的酚類物質(zhì)，從而提高提取DNA的質(zhì)量。所以該方法尤其適合以一年生或兩年生枝條為材料提取的植物總DNA，不但純度高、產(chǎn)量大，而且所用試劑無毒、操作簡便。最重要的是，本方法所用植物材料（枝條）不受季節(jié)限制，容易獲得和保存，具有較高的實(shí)際操作意義。
　　4.植物DNA的其他提取法
　　4.1改良尿素法
　　通過大量試驗(yàn)后，曹文波［6］研究出了改良尿素法，在原尿素法基礎(chǔ)上在裂解液中添加β-ME、用預(yù)冷的無水乙醇取代異丙醇沉淀核酸、采用水平離心和快速倒出用于洗滌的乙醇等操作。并從玉米和水稻葉片中提取出了高質(zhì)量的基因組DNA。此種方法的DNA產(chǎn)率高、快速省時、可在常溫下進(jìn)行操作且成本耗用低。所以用改良的方法能夠獲得純度高、濃度大的基因組DNA。
　　4.2優(yōu)化的植物總DNA提取方法
　　黃萱［7］改進(jìn)了Clark利用CTAB提取植物基因組DNA的方法，在試驗(yàn)過程中，通過在研磨材料時加入液氮、用剪去端部的吸頭轉(zhuǎn)移含有DNA的溶液，并且將加入RNase A消化RNA的步驟改在最后進(jìn)行等一系列改進(jìn)，以獲得高質(zhì)量的DNA。郭紅媛、佘茂云［8］對CTAB法與SDS法進(jìn)行了總結(jié)，研究出了一種適于棉花總DNA的提取方法，得到的DNA滿足分子生物學(xué)的進(jìn)一步研究的需要，效果顯著。
　　關(guān)于植物DNA的提取方法雖然前人已經(jīng)做了大量的研究，也總結(jié)出很多諸如CTAB法、SDS法、改良尿素法等適用范圍不同的植物DNA提取方法。但基于現(xiàn)在分子生物學(xué)的不斷深入研究，而DNA又作為分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，同時依據(jù)不同植物的特點(diǎn)，不同植物的最適合DNA的提取方法也還在不斷探究中。
　　
　　參考文獻(xiàn)：
　?。?］李先進(jìn)，彭正松，張正英.四種藥用蕨類DNA提取的比較研究［J］.綿陽師范學(xué)院學(xué)報，2008，27，（8）：85-87，97.
　?。?］黃永蓮，劉媛，黃真池.植物總DNA的提取方法的改進(jìn)［J］.湛江師范學(xué)院學(xué)報，2007，28，（3）：25-30.
　?。?］袁燕，王德斌，郭麗紅.對改良CTAB法對蒜頭果基因組DNA提純效果的影響的研究［J］.云南民族大學(xué)學(xué)報，2008，17，（2）：143-146.
　?。?］李繼東，梁啟偉，吳文娟.毛白楊成熟葉片基因組DNA提取方法的比較研究［J］.河南科學(xué)，2009，27，（3）：285-288.
　?。?］郝朝運(yùn)，劉鵬，郭衛(wèi)東.忍冬科部分植物DNA提取方法的研究［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2006，29，（1）：92-98.
　?。?］曹文波，鄭璐璐，謝文海.一種提取植物基因組DNA的方法——改良尿素法［J］.華中師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，4，（3）：448-451.
　?。?］黃萱，高麗美，張永彥.一種優(yōu)化的植物總DNA提取方法［J］.西北植物學(xué)報，2004，24，（6）：1103-1106.
　?。?］郭紅媛，佘茂云.一種改良的棉花總DNA提取方法［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37，（2）：3-5.