比較不同方法對新疆部分地區家畜布魯氏病菌種鑒定

摘要：為評估幾種方法在家畜布魯氏菌鑒定中的作用，也為了解新疆部分地區家畜布魯氏菌不同菌種在牛、羊間的感染率及在不同家畜間的轉移情況，在南北疆3個采樣點，共收集病原學組織（牛、羊流產胎兒）病料263份。經細菌分離加凝集試驗得到20株可疑布魯氏菌，對上述可疑菌株經VirB8-PCR和AMOS-PCR方法進行進一步鑒定、確定了16個布魯氏菌株，其中9株為羊種布魯氏菌，另7株為牛種菌。試驗結果顯示，采樣點家畜中，羊種布魯氏菌感染率為3.4 %，而牛種布魯氏菌感染率為2.6%。而沒發現不同家畜間菌種轉移。上述方法中，AMOS-PCR方法有特異性高、便利、快速等特點，在布魯氏病病原學鑒定中推廣和應用價值。

關鍵詞：布魯氏菌??；細菌學分離；VirB8- PCR；AMOS-PCR

Comparison of Different Methods to Identify the Domestic Animal Brucellosis Strains in Parts of Xinjiang

DUOLIKUN·Nuershafa，MIJITI·Muhetaerhan，AMANGULI·Mamuti

（Xinjiang Uyghur Autonomous Region Animal Health Epidemic Prevention and Monitoring Station，Urumqi 830011，Xinjiang，China）

Abstract：To evaluate the different methods for domesticanimal brucellosis identification， also to understand the domestic animal brucellosis different strains infection rates among the cattle and sheep and the occurrence of strains transfer in between different animals in some areas of Xinjiang.263 of pathogenic tissues （cattle， sheep aborted fetuses） samples were collected from northern and southern 3 parts of the Xinjiang.After bacteria separation and agglutination test， the 20 strains of suspicious brucellosis were isolated， among them 16 suspicious strains were further identified by using of Virb8-PCR and AMOS-PCR methods， among them 9for Br.meltitensis and7 for Br.abortus .The results showed that the infection rate of Br.meltitensis and Br.abortus was 3.4% and 2.6%respectively， in the domestic animal samples collecting area， and no evidence were founded of strain transfer between different animals. Among these different methods， the AMOS-PCR methods had high specificity， convenient， fast etc； the method has certain popularization and application value in the identification ofpathogen of brucellosis.

Key words：Brucellosis；bacterial isolation；VirB8- PCR；AMOS-PCR

布魯氏菌病是世界范圍內廣泛流行，尤其是對以畜牧業為主的發展中國家造成較大危害的重要人畜共患病[1]。傳統病原學方法在布魯氏菌病的診斷確診中是金標準、該方法以較高的特異性能夠鑒別不同種型的同時，還能確定疫區和傳染源，但與PCR方法比較，前者在耗時、操作安全性、敏感性等方面有明顯差異。PCR方法在布病病原學檢測領域中的成功利用，在一定程度上克服傳統方法的上述缺點的同時提高了布魯氏菌株種、屬性鑒定水平，而PCR方法有抗原不穩定等缺點。為此我們設計運用細菌分離加分子生物學的病原學檢測方案，對我區部分地區的牛、羊布魯氏菌菌種進行鑒定，同時了解不同菌株在不同動物間是否存在菌種轉移情況，達到通過特異、敏感、安全、快速的檢測方法，確診菌株，實施科學預防措施為目標，開展了此次檢測鑒定工作，具體檢測鑒定結果回報如下。

1資料與方法

1.1檢測病料及有關數據 在新疆南北疆設3個未布病疫苗免疫采樣點共收集病原學組織（牛、羊流產胎兒）病料263份，其中羊流產胎兒223份、牛流產胎兒40份。流產胎兒所屬畜主、飼養家畜、孕畜、流產、布病免疫情況及家人身體狀況等數據信息以填表的方式記錄保存。

1.2試驗材料

1.2.1主要試劑 瓊脂粉；胰蛋白示（TRYPTOSE）；布魯氏菌試管凝集試驗陽性、陰性血清由哈藥集團生物疫苗有限公司購置；VirB8- PCR試劑及AMOS-PCR試劑由新疆畜牧科學院獸醫研究所提供。

1.2.2儀器耗材 生物培養箱；玻璃干燥缸；PCR儀；電泳儀；圖像分析儀；一次性培養皿；蠟燭；移液槍頭；微量加樣器等。

1.3方法

1.3.1布魯氏菌的分離培養 無菌取牛、羊流產胎兒，肝、脾、胃液等組織及胃內容，其中每份牛犢組織病料同時開展需氧和厭氧培養，而羔羊組織病料只進行需氧培養[2]，37℃培養7d，觀察菌落生長情況。挑取可疑菌落、用布魯氏菌陽性、陰性血清進行凝集試驗，對在陽性血清中凝集的可疑菌株，進行進一步純化培養，對純化可疑菌株、采用分子生物學PCR方法進行分析鑒定。本試驗是用PCR鑒定試驗代替傳統布魯氏菌病細菌學分離鑒定方法中的生化鑒定試驗，即不開展硫化氫產生、染料抑菌、單項特異血清A、M及粗糙R血清凝集、噬菌體裂解試驗等生化試驗。

1.3.2 PCR方法 取上述細菌學方法分離的可疑菌株，用布魯氏菌VirB8-PCR和AMOS-PCR兩種方法不同的試劑按說明進行試驗。

2結果

2.1布魯氏菌可疑菌株的分離 細菌學分離方法共分離20株可疑菌株，其中從羊流產胎兒中分離到11個株菌，牛流產胎兒中檢出9個株菌。

2.2 VirB8- PCR和AMOS-PCR試驗結果 從上述20株可疑菌中，VirB8-PCR方法檢出了19株布魯氏菌（見圖1部分菌），但是該試劑不能鑒別該菌的種屬，AMOS-PCR方法檢出16株布魯氏菌（見圖2部分菌），同時該試劑能鑒別牛種和羊種布魯氏菌，其中9株羊流產胎兒分離菌株均為羊種布魯氏菌，7株牛分離菌株均為牛種布魯氏菌，羊種布魯氏菌感染率為3.4%、牛種布魯氏菌感染率為2.6%。檢測結果顯示不同畜間未發現布魯氏菌菌種轉移現象。細菌學方法及兩種PCR方法鑒別結果的對比，見表1和圖3。VirB8- PCR布魯氏菌均出現的擴增帶為716 bp，AMOS-PCR牛種、羊種布魯氏菌均出現的擴增帶分別為498 bp和731 bp。

圖1 VirB8- PCR 檢測結果顯示 圖2 AMOS-PCR 檢測結果顯示

注：圖1：VirB8- PCR擴增結果，M：Marker.1：羊流產胎兒中分離可疑菌株：1#、2#、4#、5#。牛流產胎兒中分離可疑菌株：3#、6#。圖2：AMOS- PCR擴增結果，M：Marker.1：羊流產胎兒中分離可疑菌株：1#、2#、3#、4#、5#、6#、8#，牛流產胎兒中分離可疑菌株7#、9#。

圖3 細菌學方法及兩種PCR方法鑒別結果的對比圖

3討論分析

3.1布魯氏菌病的病原學檢測在布病疫情判斷，成功實施有效防制措施等方面最可靠和重要方法之一。布魯氏菌病細菌學檢測方法雖然能從被檢病料中直接檢出致病菌，還能進行菌性鑒定和鑒別種、屬，但所需時間較長、比較繁瑣，條件苛刻，檢出陽性率較低[3]，生物安全性差，實驗人員需進行嚴格培訓才能操作，因此上述該方法在逐步退出檢測方法行列之中[4]。綜合上述因素，本實驗對細菌學方法進行簡化，用特異、敏感、相對安全、快速的[5]PCR方法代替細菌學生化鑒定。兩種PCR方法中VirB8- PCR方法較敏感，檢出率高，但只能鑒別布魯氏菌、不能種屬區分，而AMOS-PCR方法檢出率低，顯示特異性高，且能鑒別種屬，所以AMOS-PCR方法推廣運用的價值較高。

3.2試驗鑒定確診此次引起該流產的病因是牛感染牛種和羊感染羊種布魯氏菌。三種試驗的出菌率方面；細菌學方法疑似布魯氏菌出菌率為7.6%，VirB8- PCR為7.2%，AMOS-PCR為6.08%。AMOS-PCR方法，在出菌率方面比細菌學方法底1.52%，比VirB8- PCR底0.4%。細菌學方法與VirB8- PCR及AMOS-PCR方法的符合率，分別為95%和80%。VirB8-PCR及AMOS-PCR的特異性、比細菌分離方法分別高5%和20%，相對而言、特異性最高的是AMOS-PCR其次是VirB8- PCR和分離方法、敏感性相反。對于AMOS-PCR方法未能檢出的4株菌歸屬問題，在以后的工作繼續細菌學生化鑒定，并且與其它方法對比試驗后、給予評價。AMOS-PCR方法雖然在特異、便利、安全及快速等方面高于其它兩種方法，但是敏感性需要進一步評價。布魯氏菌患病畜群及時進行全檢、檢出陽性畜按有關規定處理后，未感染家畜進行疫苗接種，是保護人類健康、減少經濟損失、在畜間最終根除該病的最有效的方法和必要措施之一[6]。

3.3為了更好地了解我區家畜布病發病情況和制定有效預防措施，今后的檢測工作中，需進一步加大病原學檢測工作。開展有針對性的防疫工作的工作中，利用分子生物學方法對分離菌株的基因序列進行分析，準確掌握菌種特征，為各類預防措施的及時順利開展，提供科學數據。

參考文獻：

[1]Marta A，Almiron Norberto，Sanjuan .The Aggregation of Brucella abortus Occurs Under Microaerobic Conditions and Promotes Desiccation Tolerance and Biofilm Formation [J].Open Microbiol J，2013，7：87-91.

[2]李長友，李明，馬世春，等.動物布魯氏菌病防治指導手冊[M].中國農業出版社出版，2012.

[3]李堅，李鐵鋒，王艾琳.用PCR方法對布魯氏菌進行篩查及分型鑒定的研究[J].中國地方病防治雜志，2009，24（6）：300.

[4]張芳，錢愛東.布魯氏菌診斷學研究進展[J].吉林畜牧，2011，274（32）：10.

[5]姜海，崔步云，AMOS-PCR對布魯氏菌種型鑒定的應用[J].中國人獸共患病學報，2009，（25）：107.

[6]XinghongYANG，Jerod A.SKYBERG，LingCAO. Progress in Brucella vaccine development [J].Front Biol （Beijing），2013，8（1）：60-77.

編輯/張燕