Alcalase酶解高底物濃度玉米蛋白工藝優化

宋占蘭鄭喜群劉曉蘭

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

Alcalase酶解高底物濃度玉米蛋白工藝優化

宋占蘭1，2鄭喜群1，2劉曉蘭1，2

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

以玉米蛋白粉為原料，研究底物濃度、加酶量、水解液pH值和水解溫度對酶解產物水解度、可溶性蛋白含量、抗氧化活力和蛋白轉換率的影響。首先將玉米蛋白粉順次進行堿洗、α－淀粉酶去淀粉和高溫蒸煮預處理，以破壞蛋白高級結構和去除淀粉，然后以堿性蛋白酶Alcalase為生物催化劑進行玉米蛋白（10%～15%，m∶V）的限制性水解。結果表明，最適酶解條件：底物濃度13.5% （m∶V），加酶量2%，水解溫度68℃，反應體系pH值7.7，總水解時間210min。在上述條件下，蛋白水解度為28.81%，水解液的可溶性蛋白含量為31.69mg/mL，水解物抗氧化活性為547.83U/mL，蛋白轉化率為36.92%。獲得的玉米蛋白水解物的溶解性顯著增加，具有良好的抗氧化活性，顯示了其在食品和藥品等行業應用的潛力和前景。

玉米蛋白粉；堿性蛋白酶；水解度；可溶性蛋白；抗氧化活性；蛋白轉化率

以玉米為原料采用濕法生產淀粉時，可以分離出玉米干基6%左右的副產物——玉米黃粉（corn gluten meal，CGM；又稱玉米蛋白粉）。玉米黃粉中約含62%～71%的蛋白質，其余是20%的淀粉和約13%的纖維素，還含有15種無機鹽以及玉米獨有的黃色素［1］。玉米黃粉中的蛋白質主要由玉米醇溶蛋白（zein，65%～68%）和谷蛋白（glutelin，22%～23%）組成，還有少量的球蛋白（globulins，1.2%）和白蛋白（albumin）。蛋白質的營養性和功能性均取決于其氨基酸組成和結構。從營養性角度講，玉米黃粉中的蛋白質不是人類理想的蛋白質，因為玉米黃粉中含人體必須的賴氨酸、色氨酸量少，而疏水性氨基酸量多，造成氨基酸組成不平衡，這種不平衡的氨基酸組成限制了其在食品領域的應用。蛋白質的功能性必須在其具有良好的水溶性的前提下才能充分表現出來，蛋白質功能的改變基本上都是由于其結構的改變造成的，采用改變蛋白結構的加工方法或蛋白酶解技術可以將其功能特性釋放出來［2］。改性后的玉米蛋白不僅具有良好的溶解性、流動性、熱穩定性，還具有降血壓、抗氧化［3］、促酒精代謝等生理活性。本試驗針對玉米蛋白的結構特點，采用堿處理、去淀粉和高溫蒸煮依次處理玉米黃粉，再結合Alcalace蛋白酶解技術對高底物濃度玉米蛋白酶解規律進行初探。高底物濃度玉米蛋白酶解所需的設備容量小，設備利用率高。本試驗旨為玉米蛋白酶法修飾的工業應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米黃粉：黑龍江省青岡縣淀粉廠；

Alcalase堿性蛋白酶：酶活為2.7×105U/g，丹麥 NovoNordisk公司；

α－淀粉酶：酶活為2 850U/g，北京奧博星生物技術有限公司；

其他試劑：均為國產分析純。

1.2 主要儀器

紫外－可見分光光度計：TU1810，北京普析通用儀器有限責任公司；

貝克曼紫外－可見分光光度計：DU800，貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司；

凱氏定氮儀：消化系統K437，蒸餾系統B324，瑞士Buchi公司；

低速離心機：TGL－16G，北京醫用離心機廠；

pH計：PB－10，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米黃粉預處理方法

（1）堿處理：用濃度為4%的NaCO3溶液處理玉米黃粉，添加量為16mL/g，在40℃恒溫水浴鍋中處理10min，去除NaCO3溶液后按固液比1∶15（m∶V）加冷水攪拌洗滌玉米黃粉10min，洗去殘留的NaCO3溶液后，溶液于3 000r/min離心20min，去除上清液，沉淀于60℃恒溫干燥箱中烘干、研磨、備用［4］。

（2）去淀粉：用pH 6.0的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液配制成濃度為10%的堿處理后的玉米黃粉溶液，α－淀粉酶加酶量為30U/g，溫度40℃，處理2h，反應結束后酶解液在100℃ 滅酶20min，過濾去除淀粉水解產物，殘渣再用同量的蒸餾水洗滌3次，以徹底去除淀粉水解的產物。酶解液于3 000r/min離心20min，去除上清液，沉淀于60℃恒溫干燥箱中烘干、研磨、備用［5］。

（3）高溫蒸煮：將堿處理、去淀粉處理后的玉米黃粉進行高溫蒸煮，蒸煮壓力為0.1MPa，蒸煮時間為30min，料液比≥1∶2.5（m∶V）。蒸煮后玉米黃粉于60℃恒溫干燥箱中烘干、研磨、備用［6］。

1.3.2 堿性蛋白酶Alcalase水解高底物濃度玉米蛋白粉的條件優化 將預處理后的玉米黃粉按一定底物濃度用pH 8.5的50mmol/L的Tris－HCL緩沖液配制成玉米黃粉溶液［3］，加入一定量的Alcalase堿性蛋白酶，在一定的溫度和pH條件下，在恒溫振蕩水浴中進行酶水解反應120min，每隔一定時間用pH－滴定法測定玉米蛋白水解度，并在此相應時間間隔分別取酶解液，酶解液立即于100℃ 沸水中加熱20min以鈍化酶活力，在3 000r/min離心20min，測定上清液中可溶性蛋白含量和抗氧化活性。

（1）單因素試驗：主要考察水解溫度、酶解液pH、底物濃度和加酶量對酶催化水解反應的影響。

（2）正交試驗：在單因素試驗基礎上，進行L9（34）正交試驗［7］，確定Alcalase堿性蛋白酶催化的最佳水解條件。

（3）確定最佳酶解時間：在最佳水解條件下酶解，確定適宜酶解時間，同時測定最佳酶解條件下酶解物的最終水解度、可溶性蛋白含量、抗氧化活性以及蛋白轉化率。

1.4 分析方法

1.4.1 水解度的測定 pH－Stat法［8］。

1.4.2 可溶性蛋白含量的測定 Folin－酚法［9］，以牛血清白蛋白（BSA）為標準蛋白。

1.4.3 抗氧化活性的測定 改進的鄰苯三酚自氧化法——微量進樣法［10］。

1.4.4 可溶性蛋白轉化率的測定 取水解、離心后得到的蛋白水解液15mL，加入10%的三氯乙酸（TCA）15mL，混合均勻靜置30min，于4 000r/min離心10min，取離心后的上清液10mL消化并進行凱氏定氮，測定可溶性蛋白轉化率［11］。

式中：

P——可溶性蛋白轉化率，%；

X——酶解液中溶于10%TCA的氮含量，g；

X0——未酶解前溶于10%TCA的氮含量，g；

S0——底物蛋白質的總氮含量，g。

1.4.5 總蛋白質含量的測定 微量凱氏定氮法［12］。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 溫度對Alcalase水解玉米蛋白的影響 溫度對玉米蛋白的水解有較大的影響［13］。溫度對反應速率的影響主要是影響反應速率常數，在較低的溫度范圍內，反應速率常數隨著溫度的增加而增加，因而酶反應速率增加。但超過一定溫度后，酶發生熱失活引起酶的催化速率下降。在底物濃度10% （m∶V）、水解液pH 8.5、加酶量3%的條件下，考察溫度分別為55，60，65℃時對Alcalase催化水解反應的影響，結果見圖1～3。

由圖1～3可知，Alcalase堿性蛋白酶在溫度65℃條件下對玉米蛋白粉的水解效果更明顯，水解度和可溶性蛋白含量都隨著水解時間的延長呈現逐漸增加的趨勢，水解120min后，酶解液水解度為24.9%，可溶性蛋白含量為26.36mg/mL，抗氧化活性呈現不規則的變化，但60min后趨于穩定，最終可達到430.05U/mL。

圖1 溫度對Alcalase水解玉米黃粉水解度的影響Figure 1 Effect of temperature on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

圖2 溫度對Alcalase水解玉米黃粉可溶性蛋白的影響Figure 2 Effect of temperature on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

圖3 溫度對Alcalase水解玉米黃粉抗氧化活性的影響Figure 3 Effect of temperature on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

2.1.2 pH對Alcalase水解玉米蛋白的影響 水解液的pH值直接影響酶與底物的結合和催化。玉米蛋白在偏堿的條件下溶解度較高，這是因為在此情況下玉米蛋白發生了解離，部分玉米蛋白內部的親水性集團暴露出來，從而提高了玉米蛋白的水溶性［14］。在底物濃度10%（m∶V）、水解溫度60℃、加酶量3%的條件下，考察水解液pH分別為8.0，8.5，9.0時對 Alcalase催化水解反應的影響，結果見圖4～6。

圖4 pH對Alcalase水解玉米黃粉水解度的影響Figure 4 Effect of pH on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

圖5 pH對Alcalase水解玉米黃粉可溶性蛋白含量的影響Figure 5 Effect of pH on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

圖6 pH對Alcalase水解玉米黃粉抗氧化活性的影響Figure 6 Effect of pH on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

由圖4～6可知，Alcalase堿性蛋白酶在pH為8.0的條件下對玉米蛋白粉的水解效果更明顯，水解度和可溶性蛋白含量都隨著水解時間的延長而逐漸增加，最高水解度可達到25.78%，可溶性蛋白含量可達28.47mg/mL，抗氧化活性呈現不規則變化，但最終較高，可達到411.37U/mL。

2.1.3 底物濃度對Alealase水解玉米蛋白的影響 底物濃度與反應速度和產物生成量都有關系。當玉米蛋白底物濃度較小時，酶相對過量，底物不足以結合所有的酶，使得一部分酶未能充分發揮其作用，隨著底物濃度的增大，過量的酶與底物充分結合，水解度隨底物濃度的增加而增大，當酶完全與底物結合后，這種增加的趨勢逐漸減弱。在水解溫度60℃、水解液pH 8.5、加酶量3%的條件下，考察底物濃度分別為10%，13%，15%（m∶V）時對Alcalase催化水解反應的影響，結果見圖7～9。

由圖7～9可知，Alcalase堿性蛋白酶在底物濃度13%（m∶V）條件下對玉米蛋白粉的水解效果更明顯，水解度隨著水解時間的延長呈現逐漸增加的趨勢，最高水解度可達到27.31%，可溶性蛋白含量可達27.16mg/mL，抗氧化活性在前40min呈現逐漸增大的趨勢，40min之后趨于穩定，可達到461.54U/mL。

圖7 底物濃度對Alcalase水解玉米黃粉水解度的影響Figure 7 Effect of concentration of substrate on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

圖8 底物濃度對Alcalase水解玉米黃粉可溶性蛋白含量的影響Figure 8 Effect of concentration of substrate on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

圖9 底物濃度對Alcalase水解玉米黃粉抗氧化活性的影響Figure 9 Effect of concentration of substrate on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

2.1.4 加酶量對Alcalase水解玉米黃粉程度的影響 水解反應速度的快慢直接和酶的濃度相關［15］。當加酶量較小時，隨著加酶量的增加，參與反應的酶的分子越多，相應的酶解速度就越快。當加酶量較大時，產物積累對酶的競爭性抑制較大，反應速率降低。在底物濃度10%（m∶V）、水解液pH 8.5、水解溫度60℃的條件下，考察水解液加酶量分別為1%，2%，3%時對Alcalase催化水解反應的影響，結果見圖10～12。

圖10 加酶量對Alcalase水解玉米黃粉水解度的影響Figure 10 Effect of rafio of E：S on degree of hydrolysis of corn gluten by Alcalase

圖11 加酶量對Alcalase水解玉米黃粉可溶性蛋白含量的影響Figure 11 Effect of rafio of E：S on soluble protein of corn gluten hydrolysate by Alcalase

圖12 加酶量對Alcalase水解玉米黃粉抗氧化活性的影響Figure 12 Effect of c rafio of E：S on antioxidative activity of corn gluten hydrolysate by Alcalase

由圖10～12可知，當加酶量（E：S）大于2%時，玉米蛋白水解度和可溶性蛋白含量隨加酶量的增加其上升的幅度不明顯，而且抗氧化活性有下降趨勢，再通過增加酶量的方法來提高水解度不會有顯著的改善。因此，根據酶成本及生物活性肽的釋放，試驗范圍內的Alcalase堿性蛋白酶酶解最適加酶量為2%，此時酶解液水解度為25.59%，可溶性蛋白含量為24.9mg/mL，抗氧化活性呈現不規則的變化，但90min后逐漸升高，最終可達到411.37U/mL。

2.2 酶解條件的進一步優化

在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗方法，進一步優化酶解條件。以玉米黃粉水解度（DH）為指標，對底物濃度（A）、水解溫度（B）、加酶量（C）和pH（D）4個因素選用四因素三水平試驗表L9（34）以確定Alcalase酶解高底物濃度玉米黃粉的最佳條件，L9（34）正交試驗因素水平表見表1，L9（34）正交試驗方案及結果見表2，方差分析表見表3。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

表2 L9（34）正交試驗方案及結果Table 2 Design and result of orthogonal test of L9（34）

由表2可知，極差分析得出影響Alcalase酶解高底物濃度玉米蛋白酶解物水解度的因素主次順序為溫度（B）＞底物濃度（A）＞加酶量（C）＞pH（D），最佳組合為 A3B3C2D1。由表3對正交試驗結果的方差分析表明，底物濃度、溫度、加酶量和pH對水解度的影響均具有顯著性，當底物濃度為13.5%（m∶V），水解溫度為68℃，加酶量為2%，pH 為7.7，酶解時間為120min時，酶解液水解度為26.06%，可溶性蛋白含量為28.40mg/mL，抗氧化活性為338.46U/mL，蛋白轉換率為35.27%。

表3 方差分析表?Table 3 Analysis of variance table

2.3 適宜酶解時間的確定

以水解液可溶性蛋白含量和抗氧化活性為檢測指標，在底物濃度13.5%，水解溫度68℃，加酶量2%，pH值7.7條件下進行酶解，考察適宜的水解時間。結果見圖13。

圖13 Alcalase玉米黃粉蛋白水解物可溶性蛋白含量和抗氧化活性隨水解時間的變化Figure 13 The content of soluble protein and antioxidative activity of hydrolysate by Alcalase during hydrolysis

在最適的溫度和pH值條件下，水解物的可溶性蛋白含量隨水解反應時間的延長而增加，在開始水解反應的30min內，水解物抗氧化活性的增加趨勢與可溶性蛋白含量一致，30min后開始下降，在反應50min時達到最低點，隨后抗氧化活性呈不規則變化，在210min時抗氧化活性達到最大值，可溶性蛋白含量也趨于平緩。綜合考慮，蛋白酶Alcalase水解玉米黃粉蛋白適宜的時間為210min，此時酶解物水解度為28.81%，可溶性蛋白含量為31.69mg/mL，抗氧化活性為547.83U/mL，蛋白轉化率為36.92%。試驗結果與低底物濃度（5%）玉米蛋白酶解［2］進行比較可知，酶解物水解度變化不大，但水解物可溶性蛋白含量提高了13.75%，抗氧化活性提高了60.76%。

3 結論

本試驗以依次經過堿處理、α－淀粉酶去淀粉、高溫蒸煮處理的玉米黃粉為底物，采用Alcalase堿性蛋白酶對其酶解，通過單因素和正交試驗確定了Alcalase堿性蛋白酶的最適酶解條件。結果表明：Alcalase堿性蛋白酶水解高底物濃度玉米蛋白的最適酶解條件為底物濃度13.5%（m∶V），水解溫度68℃，加酶量2%，水解液pH 7.7，在此條件下水解210min酶解基本結束，此時酶解物水解度為28.81%，可溶性蛋白含量為31.69mg/mL，抗氧化活性為547.83U/mL，蛋白轉化率為36.92%。高底物濃度玉米蛋白酶解不但可以提高設備利用率、節約成本，而且能夠提高產物的溶解性和抗氧化活性。

1 尤新.玉米深加工的循環經濟發展道路［J］.糧食加工，2007，32（1）：14～18.

2 鄭喜群.玉米黃粉的酶解工藝與抗氧化活性肽的制備［D］.北京：中國農業大學，2006.

3 Xi－qun Zheng，Li－te Li，Xiao－lan Liu，et al.Production of hydrolysate with antioxidative activity by enzy matic hydrolysis of extruded corn gluten［J］.Appl microbial biotechnol，2006（73）：763～770.

4 Maeno M，Yamamoto N，Takano T.Identification of an anti hypertensive peptJde from easein hydrolysate produced by aproteinase from Lactobaei lus hel［J］.J.DairY.Sci.，1996，79：1 316～1 321.

5 李秀梅.酶法和濃醪發酵法改性玉米蛋白的研究［D］.齊齊哈爾：齊齊哈爾大學，2009.

6 王曉杰，鄭嘉群，劉曉蘭，等.雙酶復合水解度玉米蛋白酶解效率的影響［J］.中國釀造，2010（12）：98～101.

7 金英姿，龐彩霞.堿性蛋白酶水解玉米蛋白工藝條件的研究［J］.食品研究與開發，2006，27（3）：44～45，79.

8 Lowry O H，Rosebrough N J，Farr A L，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent［J］.Journal of Biological Chemistry，1951，193：264～275.

9 陳毓荃，馬靜芳，文建雷，等.生物化學實驗方法和技術［M］.北京：科學出版社，2002.

10 謝衛華，姚菊芳，袁勤生.鄰苯三酚氧化法測定SOD活性［J］.醫藥工業，1988，19（5）：217～219.

11 田斌，董文賓，朱振寶.中性蛋白酶水解蕎麥蛋白的研究［J］.現代食品科技，2008，24（1）：67～75.

12 Yazm guehi M，Nishikiori F hoM.llIe effects of peptide ingestlon on facilltating alcohol metabolism in healty men［J］.Bioaci Biotach Biochem，1997，61（9）：1 474～1 481.

13 劉萍，陳黎斌，楊嚴俊.酶解玉米蛋白制備降血壓肽的研究［J］.食品工業科技，2006，27（5）：117～119，122.

14 Katsumi Sako.Branched.chain amino acids supplements inthe late evening decrease the frequency of muscle cramps withadvanced hepatic cirrhoss［J］.Hepatology Research，2003，26：327～329.

15 何莉萍，劉良忠.中性蛋白酶和堿性蛋白酶對玉米蛋白水解作用的研究［J］.食品科學，2008，29（3）：152～157.

Optimization of hydrolysis condition on high concentration of corn gluten by Alcalase

SONG Zhan－lan1，2ZHENG Xi－qun1，2LIU Xiao－lan1，2

（1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar，Heilongjiang161006，China；2.Key Constructive Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province Normal University，Qiqihar，Heilongjiang161006，China）

By using corn gluten meal as raw material，the effects were studied to level of hydrolysis，quantity of dissolve protein，antioxidation ability and ratio of protein conversion from substrate concentration，enzyme addition，hydrolysate pH value，hydrolysis temperature.Firstly，corn gluten meal was conducted through alkali wash，starch removal byα－amylase，and a pretreatment of thermophilic digestion，in order to breakdown higher－order structure of protein and remove starch.Then，Alcalase，which was used as biocatalyst，was to hydrolyze corn gluten meal（10%－15%，m∶V）.The effects of substrate concentration，enzyme addition content，pH，and tempera－ture on degree of hydrolysis，were investigated.The content of soluble protein，antioxidative activity，and the ratio of protein conversion were investigated.The best hydrolysis results was obtained by conducting the hydrolysis at 68 ℃ with substrate concentration 13.5%（m∶V），enzyme addition 2%，pH 7.7and 210min.Under the optimal condition，degree of hydrolysis of corn gluten meal reached 28.81%，the content of soluble protein of hydrolysates was 31.69mg/mL，antioxidative activity was 547.83U/mL，and the ratio of protein conversion reached 36.92%.The solublity of the hydrolysates increased significantly and displayed good antioxidative activity.The results indicated that the hydrolysates had potential and promising application in the filed of food and medicines industry.

corn gluten；alcalase；hydrolyzing degree；soluble protein；antioxidant activity；protein conversion rate

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.061

國家自然科學基金資助項目（編號：31071629）；黑龍江省自然科學基金資助項目（編號：B200919）

宋占蘭（1986－），女，齊齊哈爾大學在讀碩士研究生。E－mail：libaosheng521＠126.com

鄭喜群

2011－08－01