不同分子量和不同酯化度蘋果果膠的研究

趙光遠(yuǎn) 刁華娟 荊利強(qiáng)

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

不同分子量和不同酯化度蘋果果膠的研究

趙光遠(yuǎn) 刁華娟 荊利強(qiáng)

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

對不同分子量和不同酯化度（DE值）蘋果果膠進(jìn)行研究。采用醇沉法制備蘋果果膠，然后分別用酸解法制備不同分子量果膠，用堿法脫酯制備不同DE值果膠。用高效液相色譜法測定果膠分子量，用滴定法測定果膠酯化度。結(jié)果表明：隨酸解和脫酯時間的延長，果膠分子量和DE值逐漸降低。

蘋果果膠；分子量；DE值

果膠廣泛分布于植物體內(nèi)，是由α－（1→4）－D－吡喃半乳糖醛酸單位組成的聚合物，主鏈上還有α－L－鼠李糖殘基。各種果膠的主要差別是它們的相對分子質(zhì)量和甲氧基含量或酯化度不同［1］。在果汁的加工過程中，果膠的相對分子量和酯化度會影響果汁的黏度、顆粒大小和Zeta電位。Shomer等［2］發(fā)現(xiàn)果膠的相對分子質(zhì)量會影響桔汁的絮凝。Yemenicioglu等［3］認(rèn)為當(dāng)蘋果果膠適當(dāng)?shù)拿撊ゲ糠旨柞セ筘?fù)電荷增多，懸浮顆粒之間的靜電斥力更大，使果汁的混濁穩(wěn)定性增強(qiáng)。

本試驗(yàn)采用醇沉法制備蘋果果膠，然后用酸解法制備不同分子量果膠和用堿法脫酯制備不同酯化度果膠。并采用高效液相色譜法測定果膠分子量，用滴定法測定果膠酯化度。研究的意義在于用無機(jī)化學(xué)條件模擬蘋果中果膠酶對果膠的作用，制備出提高渾濁蘋果汁穩(wěn)定性的果膠，為果汁產(chǎn)業(yè)提供重要的科學(xué)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蘋果：鄭州市場；

DEAE Sepharose CL－6B：美國Pharmacia公司；

所用試劑：均為分析純；

高速冷凍離心機(jī)：HC－3618R，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；

高效液相色譜儀：Waters 515，美國 Waters公司；

紫外－可見分光光度計：T6新世紀(jì)型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

傅里葉紅外光譜儀：TENSOR27型，德國Bruker Optik Gmbh公司；

梯度混合器：TH－500型，上海滬西分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 果膠制備 參照Brett等的方法［4］，改進(jìn)如下：

取果肉組織400g，加入500mL含有3.3g十二烷基磺酸鈉（SDS）的熱無水乙醇，用組織搗碎機(jī)打漿8min后加熱回流10min。待漿液冷卻至40℃左右時趁熱離心（8 000r/min，20min，25℃），然后將殘渣依次用80%，90%，95%無水乙醇洗滌離心（5 000r/min，15min，15℃），棄去上清液，再將殘渣用丙酮洗滌離心3次（5 000r/min，15min，15℃），棄去上清液，然后45℃水浴干燥。得到的樣品即為細(xì)胞壁物質(zhì)（cell wall material，CWM）。

稱取烘干的 CWM 1g，加入200mL 0.05mol/L 的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液（pH 6.5），70℃水浴加熱10min，在全溫空氣搖床上震蕩1h，然后離心（8 000r/min，30min），取上清液，50℃減壓濃縮，用80%乙醇沉淀5min后離心（5 000r/min，10min），將沉淀物40℃真空干燥，所得粉末即為水溶性果膠（WSP）。

1.2.2 果膠的純度驗(yàn)證

（1）DEAE Sepharose CL－6B陰離子交換色譜分析：稱取果膠20mg，加2mL去離子水溶解，樣液離心（5 000r/min，10min），取上清液加樣至DEAESepharose CL－6B 柱（2.6cm ×20cm）。先用80mL去離子水洗脫，再用600mL 0～2mol/L NaCl線性梯度洗脫。洗脫流速為0.8mL/min，每管收集15min，以硫酸－苯酚法檢測多糖（490nm）。

（2）果膠的紫外光譜測定：將分離純化，真空干燥后的果膠配成濃度為0.5mg/mL的溶液，采用T6新世紀(jì)型紫外－可見分光光度計進(jìn)行掃描，掃描波長為190～400nm，觀察在260nm和280nm處是否有吸收。

（3）果膠的紅外光譜分析：將分離純化，真空干燥后的果膠，經(jīng)FT－IR紅外光譜分析儀進(jìn)行光譜分析。取1mg左右干燥的果膠，與KBr粉末壓片后置于操作臺上，在4 000～500cm－1范圍內(nèi)掃描。

1.2.3 不同分子量果膠的制備 取0.500g果膠用40mL去離子水溶解，加入濃鹽酸3.64mL使果膠液中的鹽酸濃度為1mol/L，水解溫度80 ℃，水解時間分別為5，10，15，20min，待到所需時間將果膠液取出10mL，在冰浴中迅速冷卻，然后用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)其pH至3.5，加入無水乙醇使乙醇濃度達(dá)到80%以上，以使果膠沉淀完全，沉淀5min后離心（5 000r/min，10min），將沉淀物40℃真空干燥，得到不同相對分子質(zhì)量的果膠。

1.2.4 不同酯化度果膠的制備 根據(jù)文獻(xiàn)［5］，稱取果膠0.500g用50mL去離子水溶解，然后在冰浴中降溫至4℃，用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9.0，保持果膠4℃脫酯并同時保持果膠液pH值為9.0，脫酯時間分別為10，20，30，40min，待到所需時間將果膠液取出10mL，用1mol/L的鹽酸調(diào)其pH至3.5，加入無水乙醇使乙醇濃度達(dá)到80%以上，以使果膠沉淀完全，沉淀5min后離心（5 000r/min，10min），將沉淀物40℃真空干燥，得到不同酯化度的果膠。

1.2.5 果膠相對分子質(zhì)量的測定 參考文獻(xiàn)［6］。

1.2.6 果膠酯化度測定 參照文獻(xiàn)［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠的純度驗(yàn)證

2.1.1 DEAE Sepharose CL－6B陰離子交換色譜分析 離子交換色譜可根據(jù)多糖的帶電性質(zhì)將多糖進(jìn)行分級，鑒于果膠含有較多的糖醛酸，是一種帶負(fù)電的多糖，所以采用陰離子交換色譜對其進(jìn)行鑒定。

取果膠20mg溶于2mL去離子水中，離心后上清液用DEAE Sepharose CL－6B柱色譜（Cl－型）進(jìn)行分級，用硫酸 －苯酚法在A490nm進(jìn)行檢測，其洗脫圖譜見圖1。

圖1 果膠的 DEAE Sepharose CL－6B柱層析Figure 1 Chromatogram of pectin on a DEAE Sepharose CL－6Bcolumn

DEAE Sepharose CL－6B柱：2.6×20cm；洗脫液：先用80mL去離子水洗脫，再用0～2mol/L NaCl線性梯度洗脫；洗脫流速0.8mL/min；每管收集15min。果膠的陰離子交換色譜顯示，在NaCl線性梯度洗脫區(qū)域只有一個對稱峰，說明該樣品為均一物質(zhì)，電荷特性均一，而且?guī)У氖秦?fù)電荷。

2.1.2 果膠的紫外掃描 果膠在190～400nm處的紫外吸收光譜（見圖2）表明，在260nm和280nm處無紫外吸收，說明果膠中不含蛋白質(zhì)、多肽及核酸。但在190～220nm附近有強(qiáng)的吸收峰，是多糖物質(zhì)的特征吸收峰，表明樣品中含有多糖。

圖2 果膠的紫外掃描圖譜Figure 2 The UV scan chromatogram of pectin

2.1.3 果膠的FTIR分析 對果膠在500～4 000cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行了紅外光譜分析，由圖3可知，該組分具有糖類物質(zhì)的特征吸收峰，3 100～3 500cm－1處的寬峰是糖類分子內(nèi)或分子間O－H的伸縮振動峰，說明果膠分子中或分子間有很多的－OH，該峰出現(xiàn)在3 444.2cm－1左右，說明存在著明顯的分子間氫鍵［8］；在2 932cm－1出現(xiàn)的吸收峰是糖類C－H伸縮振動峰［9］；1 754.2cm－1處的峰是 C═ O 的伸縮振動峰，說明蘋果果膠中有乙酰基存在；而1 615.2cm－1處的吸收峰是－CHO 中 C═ O 的伸 縮 振 動 峰；1 443.9cm－1和1 412.1cm－1處的峰是C－O－H的平面彎曲振動峰；1 367.3cm－1和1 338.4cm－1處的峰是 O－H 的彎曲振動峰；1 236.4cm－1處的弱峰是不對稱的C－O－C伸縮振動峰，表明有－O－CH3存在；1 000～1 200cm－1的吸收峰1 103.8cm－1和1 015.8cm－1是吡喃型糖環(huán)的醚鍵和羥基的吸收峰［10］；918.9cm－1附近的吸收峰是 D－吡喃型葡萄糖的特征吸收峰。在3 300～3 500cm－1（－NH2）處無雙峰出現(xiàn)說明無蛋白存在。

圖3 果膠的FTIR光譜圖Figure 3 FTIR spectrum of pectin

2.2 HPLC果膠相對分子質(zhì)量的測定結(jié)果

分別將已知分子質(zhì)量的葡聚糖（dextran）標(biāo)準(zhǔn)品，分子量在1 000～150 000，以0.1mol/L硝酸鈉溶液為溶劑配制濃度為4mg/mL的溶液進(jìn)行測定，繪制校正曲線，見圖4。

圖4 lgMw－Ve校正曲線Figure 4 The calibration curve of lgMw－Ve

本次試驗(yàn)運(yùn)用的是3階求導(dǎo)的數(shù)據(jù)處理方法，經(jīng)計算機(jī)數(shù)據(jù)處理直接給出重均分子量，得到校正曲線方程lgMw＝－4.87×103＋9.76×102×V－77.8×V2＋3.09×V3，R2＝1。將未酸解的果膠（酸解時間記作0min）和酸解時間分別為5，10，15，20min的果膠進(jìn)行測定，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，酸解0，5，10，15，20min果膠的重均分子量分別為97 361，87 039，84 700，81 150，74 560，隨酸解時間的延長，果膠的重均分子量逐漸減小，而且減小的趨勢不大，符合混合蘋果汁對不同分子量的要求。因?yàn)樵谡鎸?shí)的蘋果中，隨蘋果的不斷成熟或儲藏時間的不斷延長，聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）對果膠的催化也是比較緩慢的且程度也是較小的［11］。PG分為內(nèi)切－PG和外切－PG兩種，而內(nèi)切－PG只能裂開和游離羧基相鄰的糖苷鍵，因此果膠水解的速度和程度隨它的酯化程度增加而快速的下降［12］，在真實(shí)的渾濁蘋果汁體系中也要考慮到這一點(diǎn)。

圖5 酸解果膠的分子量色譜圖Figure 5 Chromatogram of pectins by acidolysis

2.3 果膠酯化度的測定結(jié)果

適當(dāng)改變果膠的DE值會改變果膠的帶電性，從而改變果汁的穩(wěn)定性。在一些水果和蔬菜的加工中，天然存在的果膠酯酶起保護(hù)果蔬質(zhì)構(gòu)的作用。果蔬在低溫下的長時間熱燙會激活組織中的果膠酯酶，從而導(dǎo)致果膠的部分脫酯，從而可以改變果蔬汁的渾濁穩(wěn)定性［12］。

表1 果膠酯化度測定結(jié)果Table 1 The determination results of pectins DE value

由表1可知，隨果膠脫酯時間的延長，果膠的酯化度逐漸降低，但降低的趨勢不大，符合果汁對不同酯化度果膠的要求。

蘋果果膠在堿法脫酯時，除了分子的甲酯化度降低外，同時還會產(chǎn)生果膠分子的解聚，即所謂的β－消去反應(yīng)，見圖6。

圖6 果膠的β－消去反應(yīng)Figure 6 β－elimination reaction of pectin

β－消去反應(yīng)會導(dǎo)致果膠分子量的降低。果膠的脫酯反應(yīng)和β－消去反應(yīng)往往同時發(fā)生，但反應(yīng)條件不同時，兩者的反應(yīng)速度不同。研究［13］表明，溫度升高時（25℃），β－消去反應(yīng)速度大于脫酯反應(yīng)。為了制取合適酯化度的果膠，同時又要保持蘋果果膠的分子量盡量不改變，應(yīng)盡量避免果膠在脫酯時分子的降解即β－消去反應(yīng)。所以本試驗(yàn)在脫酯時保持反應(yīng)溫度為4℃。

3 結(jié)論

所提取的果膠經(jīng)DEAE Sepharose CL－6B陰離子交換色譜分析為均一物質(zhì)，電荷特性均一，而且?guī)У氖秦?fù)電荷；紫外掃描表明，所提取的果膠樣品在190～220nm附近有強(qiáng)的多糖吸收峰，且無蛋白的特征吸收峰；經(jīng)紅外掃描表明，所提取的果膠樣品有糖類的特征吸收峰，且有甲氧基和乙酰基存在。以上均表明試驗(yàn)中所提果膠純度較高，且不含蛋白。

通過高效液相色譜法測定不同酸解時間得到的果膠重均分子量，表明隨酸解時間的延長，分子量逐漸降低。通過滴定法測定不同脫酯時間得到的果膠的DE值，表明隨脫酯時間的延長，DE值逐漸降低。

1 謝筆鈞.食品化學(xué)［M］.第2版.北京：科學(xué)出版社，2001：117～118.

2 Shomer I，Yefremov T，Merin U.Involvement of Protein in cloud instability of shamouti orange juice［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47：2 623～2 631.

3 Yemenicioglu A，Gunaydin N，Cemeroglu B.Cloud stabilization of naturally cloudy apple juices by heat treatments［J］.Journal of Fruit Processing，2000，10（7）：278～282.

4 Brett C T，Waldron K W.Physiology and Biochemistry of plant cell walls［M］.London：Unwin－Hyman，1990：6～43.

5 Catherine M G C R，Jean F T.Degradation of pectins in alkaline conditions：kinetics of demethylation［J］.Journal of Carbohydrate Research，1996，286：139～150.

6 趙光遠(yuǎn)，刁華娟.果膠對果膠－麥醇溶蛋白－兒茶素模擬體系的穩(wěn)定性影響［J］.食品科學(xué)，2011，32（18）：68～71.

7 Pinheiro E R，Silva I M D A，Gonzaga L V，et al.Optimization of extraction of high－ester pectin from passion fruit peel（Passiflora edulis flavicarpa）with citric acid by using response surface methodology［J］.Bioresource Technology，2008，99：5 561～5 566.

8 Ni W H，Zhang Xu，Bi H T，et al.Preparation of a glucan from the roots of rubus crataegifolius beg and its immunological activity［J］.Carbohydrate Research，2009，344：2 512～2 518.

9 Car W，Li X Q，Liu L，et al.Structure analysis of water－soluble glucans from the root of Angelica sinensis diels［J］.Carbohydrate Research，2006，341：1 870～1 877.

10 Ding X，F(xiàn)eng Su，Cao Mei，et al.Structure characterization of polysaccharide isolated from the fruiting bodies of Tricholoma matsutake［J］.Carbohydrate Polymers，2010，81：942～947.

11 Giovannoni JJ，Dellapenna D，Bennettab，et al.Expression of a chimeric polygalacturonase gene in transgenic rin （ripening inhibitor）tomato fruit results in polyuronide degradation but not fruit softening［J］.The Plant Cell，1989，1（1）：53～63.

12 王璋.食品酶學(xué)［M］.第1版.北京：中國輕工業(yè)出版社，1991：168～170.

13 雷激，馬力，趙義梅，等.低溫減法脫酯制取低酯果膠的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（1）：45～48.

Studies on apple pectins of different molecular weight and different degree of esterification

ZHAO Guang－yuan DIAOHua－juanJING Li－qiang

（School of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，Henan450002，China）

Studied the preparation of apple pectins of different molecular weight and different degree of esterification was studied.Alcohol precipitation was applied to the preparation of apple pectins，and acidolysis and alkaline de－esterification was applied to get pectins of different molecular weight and different DE value.The molecular weight of pectins was determined by HLCP and DE value of pectins was assayed by titrimetry.The results showed that with the increment of reaction time，molecular weight and DE value of pectin decreased.

apple pectin；molecular weight；DE value

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.011

河南省杰出青年基金項(xiàng)目（編號：104100510022）；河南省青年骨干教師資助項(xiàng)目（編號：72009086）

趙光遠(yuǎn)（1973－），男，鄭州輕工業(yè)學(xué)院副教授，博士。E－mail：guangyuan－zhao＠163.com

2011－08－01