迷迭香中鼠尾草酸分離純化及抗氧化能力指數測定

杜紀權 徐 鴻 陳雪香 肖蘇堯 曹 庸

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

迷迭香中鼠尾草酸分離純化及抗氧化能力指數測定

杜紀權 徐 鴻 陳雪香 肖蘇堯 曹 庸

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

迷迭香提取物經初步預處理后，通過RP－C18填料對其進行分離純化得到鼠尾草酸。采用ORAC（oxygen radical absorbance capacity）分析方法測定鼠尾草酸的抗氧化能力指數，并與常用的合成抗氧劑BHA、BHT及天然抗氧化劑VE進行對比。結果表明，當洗脫劑為甲醇∶0.1%磷酸＝80∶20（V／V），負載量為1.5g，洗脫速度為4mL／min時，對鼠尾草酸的分離效果較好，其純度≥94%，回收率≥93%。同時，ORAC測定結果表明，鼠尾草酸的抗氧化能力指數是BHT、VE的3倍，而低于BHA。

迷迭香；鼠尾草酸；抗氧化能力指數

迷迭香系唇形科迷迭香屬植物，原產于地中海地區。目前，在中國貴州、云南、海南和新疆等地都有栽培［1］。迷迭香含有大量的抗氧化成分，具有很強的抗氧化性，是一種優良的天然抗氧化劑［2，3］。研究［4，5］表明，在迷迭香的眾多抗氧化成分中，鼠尾草酸是含量最高、抗氧化性最強的成分。目前，市場上銷售的商品化迷迭香提取物的質量和價格是與鼠尾草酸含量高度相關的［6］。

本試驗對使用RP－C18填料分離純化迷迭香提取物中鼠尾草酸的工藝進行研究，采用AOAC標準方法－ORAC分析方法測定了鼠尾草酸的抗氧化能力指數，為鼠尾草酸的分離純化提供了一條新途徑，同時為中國生產迷迭香抗氧化劑的企業，在實行國際標準化質量控制方面提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

迷迭香提取物：鼠尾草酸純度≥30%，廣州合誠三先生物科技有限公司；

鼠尾草酸標準品：純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，德國Merck公司；

2，2′－偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）：美國 Sigma公司；

Trolox：純度≥97%，美國Sigma公司；

熒光素鈉：美國Sigma公司；

VE：純度≥90%，德國Merck公司；

BHA、BHT：廣益食品添加劑實業有限公司；

Lichroprep RP－C18填料：德國Merck公司；

電子天平：PL－203，梅特勒－托利多儀器有限公司；

高效液相色譜儀：LC－10ATVPplus，日本島津制造所；

數顯恒流泵：BT－200B，上海青浦滬西儀器廠；

層析柱：1.5×50cm，上海錦華層析設備廠；

色譜柱：Diamonsil（鉆石）C18柱 （200×4.6mm），北京迪馬科技有限公司；

旋轉蒸發儀：RE－201，上海申生科技有限公司；

酶標儀：1420型，美國Perkin Elmer公司；

1.2 試驗方法

1.2.1 高效液相色譜定量測定的方法

（1）定量測定的條件：流動相為甲醇∶0.1%磷酸＝85∶15（V／V），流速為1mL／min，進樣量為10μL，柱溫為25℃，檢測波長為230nm。在該條件下，鼠尾草酸在11min左右出峰，鼠尾草酚在4min左右出峰，峰形良好。

（2）標準曲線的繪制：精密稱取鼠尾草酸標準品12.5mg，用無水乙醇溶解并定容于25mL容量瓶中，得到0.5mg／mL鼠尾草酸標準儲備液。精確移取儲備液8，6，4，2，1mL用無水乙醇定容于10mL容量瓶中，配制成不同濃度的標準溶液。依次取10μL上述標準溶液進樣，以峰面積為縱坐標，以鼠尾草酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。結果表明，鼠尾草酸在0.05～0.5mg／mL的濃度范圍內，呈現良好的線性關系，其線性回歸方程及相關系數為y＝16 432 878x＋74 143，R2＝0.999 9。

（3）樣品中鼠尾草酸的純度及回收率計算：精密稱取一定量的樣品，用無水乙醇溶解并定容于25mL容量瓶中，取10μL進樣，記錄峰面積，根據標準曲線計算溶液中鼠尾草酸的濃度，并按式（1）和式（2）計算樣品中鼠尾草酸的純度及回收率：

式中：

P——樣品中鼠尾草酸純度，%；

C——被測液中鼠尾草酸濃度，mg／mL；

V——被測液體積，mL；

m—— 稱取樣品的質量，mg；

Q——鼠尾草酸回收率，%；

P1——柱層析后樣品中鼠尾草酸的純度，%；

P2——柱層析前樣品中鼠尾草酸的純度，%；

m1——柱層析后得到的鼠尾草酸組分的干重，g；

M—— 柱層析的上樣量，g。

1.2.2 迷迭香提取物的預處理 準確稱取迷迭香提取物20g，用甲醇∶水＝80∶20（V／V）攪拌提取3次，每次10min，濾液合并后濃縮至干。

1.2.3 柱層析條件優化 稱取 Lichroprep RP－C18填料35g，加入適量的甲醇，攪勻后裝柱，以洗脫劑平衡60min后即可使用。每次使用完畢，用適量甲醇再生后可重復使用。

（1）洗脫劑的選擇：根據高效液相色譜測定的條件，分別選取甲醇∶0.1%磷酸為85∶15，80∶20，75∶25（V／V）為洗脫劑，取經預處理后的迷迭香提取物1g以洗脫劑溶解后上樣，流速2mL／min，接樣10mL／管，進行柱層析試驗，監測每管鼠尾草酸和鼠尾草酚的濃度，將鼠尾草酸組分合并濃縮至干，稱重后，準確稱取一定量的鼠尾草酸組分，通過高效液相色譜測定純度并計算回收率，以確定最佳洗脫劑比例。

（2）負載量的確定：以甲醇∶0.1%磷酸＝80∶20（V／V）為洗脫劑，分別取經預處理的迷迭香提取物1.0，1.5，2.0g以洗脫劑溶解后上樣，流速2mL／min，接樣10mL／管，進行柱層析試驗，監測每管鼠尾草酸和鼠尾草酚的濃度，將鼠尾草酸組分合并濃縮至干，稱重后，準確稱取一定量的鼠尾草酸組分，通過高效液相色譜測定純度并計算回收率，以確定最大負載量。

（3）洗脫速度的確定：以甲醇∶0.1%磷酸＝80∶20（V／V）為洗脫劑，取經預處理的迷迭香提取物1.5g以洗脫劑溶解后上樣，流速分別調為2，4，6mL／min，接樣10mL／管，進行柱層析試驗，監測每管鼠尾草酸和鼠尾草酚的濃度，將鼠尾草酸組分合并濃縮至干，稱重后，準確稱取一定量的鼠尾草酸組分，通過高效液相色譜測定純度并計算回收率，以確定最佳洗脫速度。

1.2.5 鼠尾草酸抗氧化能力指數的測定 經柱層析得到的鼠尾草酸、BHA、BHT及VE以甲醇配成100μg／mL儲備液。其中，鼠尾草酸儲備液以75mmol／L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋成8，4，2，1，0.5，0.25μg／mL 6個濃度梯度進行ORAC測定。BHA、BHT、TBHQ及VE儲備液以上述磷酸鹽緩沖液稀釋成2μg／mL，與2μg／mL鼠尾草酸進行對比測定。

測定方法：將96孔板的微孔中加入待測樣品溶液20μL，再加入75mmol／L磷酸鉀緩沖液（pH 7.4）20μL和AAPH溶液140μL（終濃度為12.8mmol／L），最后添加熒光素鈉20μL至終濃度為63nmol／L，迅速將酶標板置于預溫37℃的熒光酶標儀中，在激發波長為485nm，發射波長為527nm的條件下，進行測定。采用動力學方式，每2min測定一個點，至熒光強度衰減為零［7］。試驗結果表達為熒光衰減曲線下積分面積，扣除無抗氧化劑的空白曲線下面積，得出抗氧化劑的保護面積，并與1mol／L Trolox的保護面積進行定量比較［8］。

2 結果與分析

2.1 柱層析結果

2.1.1 洗脫劑對鼠尾草酸分離純化的影響 由圖1和圖2可知，洗脫劑中甲醇比例越低，鼠尾草酸與鼠尾草酚的在層析柱上的分離效果就越好。當洗脫劑為甲醇∶0.1%磷酸＝80∶20時，鼠尾草酸與鼠尾草酚已達到完全分離；當洗脫劑為甲醇∶0.1%磷酸＝75∶25時，兩者的分離效果得到進一步改善，但此時鼠尾草酸的純度和回收率略有下降。這可能是由于鼠尾草酸在有機溶劑中穩定性較差［9－11］，在層析過程中發生了分解。綜合考慮，以甲醇∶0.1%磷酸＝80∶20為洗脫劑，較為合適。

2.1.2 負載量對鼠尾草酸分離純化的影響 由圖3和圖4可知，負載量對鼠尾草酸與鼠尾草酚在層析柱上的分離具有非常顯著的影響。負載量過大，會導致二者在層析柱中沒有得到完全分離，出現疊加的現象；而且，負載量越大，疊加越嚴重。當負載量為1.5g時，雖然出現了部分疊加，但回收率仍達到93.8%，稍低于負載量為1.0g時的回收率（94.8%）。當負載量為2.0g時，由于鼠尾草酸與鼠尾草酚嚴重疊加，導致鼠尾草酸的純度與回收率明顯降低。因此，可確定最佳負載量為1.5g。

2.1.3 洗脫速度對鼠尾草酸分離純化的影響 由圖5和圖6可知，流速對鼠尾草酸與鼠尾草酚在層析柱上的分離也具有一定的影響。流速過高，會導致鼠尾草酸與鼠尾草酚沒有得到完全分離即被洗脫出來，從而導致鼠尾草酸的純度和回收率下降。當流速低于4mL／min時，二者能到達較好的分離；當流速高于4mL／min時，由于二者未完全分離，而導致鼠尾草酸的純度和回收率都有所下降。因此，確定最佳流速為4mL／min。

圖1 不同配比的洗脫劑對鼠尾草酸和鼠尾草酚分離效果的影響Figure 1 Effect of different ratio elution on the separation of carnosic acid and carnosol

圖2 不同配比的洗脫劑對鼠尾草酸純度及回收率的影響Figure 2 Effect of different ratio elution on the purity and percent recovery of carnosic acid

2.2 高效液相色譜測定結果

圖3 負載量對鼠尾草酸和鼠尾草酚分離效果的影響Figure 3 Effect of loaded sample volume on the separation of carnosic acid and carnosol

圖4 負載量對鼠尾草酸純度及回收率的影響Figure 4 Effect of different loaded sample volume on the purity and percent recover of carnosic acid

經測定，預處理后迷迭香提取物中鼠尾草酸純度可由30%提高到51.2%，回收率為91.4%。根據柱層析條件優化的結果，以甲醇∶0.1%磷酸＝80∶20（V／V）為洗脫劑，負載量為1.5g，洗脫速度為4mL／min，收集鼠尾草酸組分，濃縮至干，測得鼠尾草酸的純度≥94%，回收率≥93%。圖7為柱層析前樣品及柱層析后收集的鼠尾草酸組分的高效液相色譜圖，從圖7中可以看出，在此條件下，鼠尾草酸與鼠尾草酚得到了有效的分離。

2.3 抗氧化能力指數測定結果

鼠尾草酸、合成抗氧化劑BHA、BHT及天然抗氧化劑VE的抗氧化能力指數測定結果見圖8～10。

圖5 流速對鼠尾草酸和鼠尾草酚分離效果的影響Figure 5 Effect of different flow rate on the separation of carnosic acid and carnosol

圖6 流速對鼠尾草酸純度及回收率的影響Figure 6 Effect of different flow rate on the purity and percent recover of carnosic acid

結果表明，鼠尾草酸對AAPH產生的自由基具有很強的清除能力，而且存在明顯的劑量依賴關系。不同抗氧化劑的抗氧化能力指數以Trolox當量表示，見圖10。鼠尾草酸、VE、BHT、BHA 的 Trolox當量分別為 3.34，0.97，1.12，8.57μM／μg，鼠尾草酸的抗氧化能力指數是VE和BHT的3倍，而低于BHA，因此，其作為一種安全高效的天然抗氧化劑，可以作為合成抗氧化劑的良好替代品。

圖7 柱層析前及柱層析后高效液相色譜圖Figure 7 HPLC chromatograms of before and after column chromatography

圖8 不同濃度鼠尾草酸的熒光衰減曲線Figure 8 Curves of fluorescence decay of carnosic acid at different concentration

圖9 鼠尾草酸與其它抗氧化劑對比的熒光衰退曲線Figure 9 Curves of fluorescence decay of carnosic acid and other antioxidants

圖10 不同抗氧化劑的抗氧化能力指數Figure 10 ORAC of different antioxidants

3 結論

（1）采用RP－C18填料對鼠尾草酸進行分離純化，確定最佳條件：甲醇∶0.1%磷酸＝80∶20（V／V）為洗脫劑，負載量為1.5g，洗脫速度為4mL／min，此時鼠尾草酸的純度≥94%，回收率≥93%。與傳統的正相硅膠柱層析相比，其具有分離效果好，分離效率高等特點，同時RP－C18填料再生后，能多次重復使用。

（2）采用ORAC分析方法測定了鼠尾草酸的抗氧化能力指數，并與常用的合成抗氧劑BHA、BHT及天然抗氧化劑VE進行對比，發現鼠尾草酸的抗氧化能力指數是BHT、VE的3倍，低于BHA。與其他方法相比，ORAC法可以提供穩定可控的自由基，這些自由基與生命現象中的自由基具有高度的一致性［12］。因此，這對鼠尾草酸及含鼠尾草酸的迷迭香提取物作為抗氧化劑在食品及保健品中的應用，具有指導意義。

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Separation and purification of carnosic acid from rosemary and determination of oxygen radical absorbance capacity

DU Ji－quan XU Hong CHEN Xue－xiang XIAO Su－yao CAO Yong

（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510642，China）

Carnosic acid was separated and purified from the pretreated rosemary extract by RP－C18Silica gel.Its antioxidant capacity was determined by ORAC，and compared with VE，BHA and BHT.When methanol－0.1%phosphoric acid solution（80∶20）was used as mobile phase at flow rate of 4mL／min and 1.5g pretreated rosemary extract was loaded，the purity of carnosic acid can be more than 94%and percent recovery can be more than 93%.And its antioxidant capacity was three times greater than VEand BHT，but less than BHA.

rosemary；carnosic acid；oxygen radical absorbance capacity

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.06.021

廣州經濟技術開發區科技項目（編號：2009Q－P090）

杜紀權（1986－），男，華南農業大學在讀碩士研究生。E－mail：dujiquan211＠163.com

曹庸

2011－08－01