膠束電動毛細管色譜法測定何首烏中的二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚

吳 嫻，陳冠華，王 坤，石 杰，武傳芹

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013）

膠束電動毛細管色譜法測定何首烏中的二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚

吳 嫻，陳冠華，王 坤，石 杰，武傳芹

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013）

采用膠束電動毛細管色譜法，建立測定何首烏中二苯乙烯苷、大黃素、大黃酚的新方法，對影響分離的諸因素進行了優化。緩沖液組成為25 mmol／L硼砂-40 mmol／L十二烷基硫酸鈉-10%（體積分數）乙醇，p H值為9.5。在優化的條件下，二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚可于20 min內分離；線性范圍分別為10～1 000，5.2～260，4.5～225 mg／L；檢出限分別為1.10，0.29，0.43 mg／L；平均加標回收率分別為98.8%，98.8%，100.7%。該方法可滿足何首烏中二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚的測定要求，可作為何首烏藥材的質量控制方法。

膠束電動毛細管色譜；何首烏；二苯乙烯苷；大黃酚；大黃素

何首烏為蓼科植物何首烏的干燥塊根，其根和莖所含蒽醌類、二苯乙烯苷類和磷脂類化合物是其藥理作用的物質基礎。二苯乙烯苷（2，3，5，4＇-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷）為何首烏主要的水溶性成分，具有抗衰老［1］、提高免疫力、防止動脈硬化和保肝的藥理作用，其含量作為何首烏及其制劑的質量控制指標。蒽醌類成分是何首烏中公認的主要活性成分，現代藥理學研究表明其具有抗菌消炎、利尿和抗腫瘤［2］、調節免疫功能［3］等作用。

目前文獻報道對二苯乙烯苷、大黃素、大黃酚的測定方法主要有紫外分光光度法、熒光法、薄層層析法、高效液相色譜法［4－8］。膠束電動毛細管色譜（MECC）是毛細管電泳的一種分離模式，具有分離效率高、分析速度快、樣品用量和試劑消耗小等突出優點，被廣泛應用于蒽醌類［9－10］、皂苷類［11－14］、酚酸類［15－16］、黃酮類［17］、內酯類［18］和生物堿類［19－20］等多種天然藥物成分的分離檢測。尚小玉等在5 min內實現了對大黃中大黃酚、大黃素、土大黃苷和大黃酸的分離［21］；張國慶等分離了何首烏中的7種蒽醌類成分，但僅能檢測出大黃素和大黃酸［22］；袁海龍等報道了以毛細管區帶電泳模式檢測何首烏中二苯乙烯苷的方法［23］。對何首烏中二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚進行同時分離測定，可以為何首烏藥材質量控制以及何首烏藥效成分提取工藝研究提供檢測方法，目前尚無采用MECC法對此3種成分進行同時分離檢測的報道。筆者對此進行了研究，與已報道的HPLC同時測定何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類的方法相比，本方法分析時間較短，3種成分可同時檢出。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CL1020高效毛細管電泳儀（北京彩陸科學儀器有限公司提供）；電源（電壓0～30 k V可調）；未涂層熔融石英毛細管柱（62 cm×75μm，有效長度為50 cm，產地為河北永年）；HW-2000色譜工作站（邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司提供）；高速中藥粉碎機（青州市精密制藥機械制造有限公司提供）；BS124S電子分析天平（賽多利斯公司提供）；p HS-2型酸度計（上海第二分析儀器廠提供）；B5500S-MT超聲清洗機（上海必能信超聲有限公司提供）；優譜超純水機（成都超純科技有限公司提供）。

何首烏（鎮江市售）；二苯乙烯苷對照品（昆明科翔生物科技有限公司提供，純度＞98%）；大黃酚、大黃素對照品（上海博蘊生物技術有限公司提供，純度＞98%）；硼砂、十二烷基硫酸鈉（SDS）、甲醇，均為分析純；水為二次重蒸水（電阻率為182 kΩ·cm）。

1.2 電泳條件

重力進樣（16 cm×5 s），分離電壓為15 k V，檢測波長為254 nm，溫度為25℃。緩沖體系為25 mmol／L硼砂-40 mmol／L的SDS-10%（體積分數）乙醇，p H 值為9.5。

第1次使用前，依次用1.0 mol／L的 HCl、水、0.1 mol／L的 NaOH、水和緩沖溶液沖洗毛細管5，3，10，3，10 min，在2次運行之間依次用水、0.1 mol／L的 NaOH、水和緩沖溶液沖洗毛細管1，2，1，2 min。為了保證重現性，緩沖溶液每運行3次后要進行更新。

1.3 標準和樣品溶液制備

精密稱定二苯乙烯苷、大黃素、大黃酚適量，分別以甲醇為溶劑，配制成標準儲備液（二苯乙烯苷質量濃度為1 000 mg／L，大黃素質量濃度為520 mg／L，大黃酚質量濃度為450 mg／L），于4℃保存。在使用前，用甲醇稀釋為不同質量濃度的工作溶液。

將一定量的何首烏粉碎過177μm（80目）篩。準確稱取0.5 000 g，加入30 m L甲醇溶液，超聲提取60 min，冷卻至室溫，浸泡12 h后過濾。將濾渣用20 m L甲醇超聲提取60 min后過濾，合并2次濾液，減壓濃縮并定容至10 m L，用0.45μm濾膜過濾備用。

2 結果與討論

2.1 硼砂緩沖液p H值的選擇

緩沖液p H值對組分的峰形和遷移時間均有影響。當p H值低于8.5時，大黃素和大黃酚在60 min內未見出峰；隨著p H值的升高，兩者均可出峰，但大黃酚峰形有拖尾現象，這種現象是大黃素和大黃酚在較低p H值條件下發生沉淀析出并被吸附于管壁上所造成的。如圖1所示，隨著p H值的繼續上升，組分的峰寬逐漸變窄，拖尾現象得到改善。當p H值在9.5以上時，大黃酚拖尾現象消失，但遷移時間會有所增加，綜合考慮遷移時間，選擇緩沖液的最佳p H值為9.5。

2.2 硼砂濃度的影響

緩沖液濃度在一定范圍內可影響到電滲流、組分與管壁的相互作用和組分區帶的擴散。圖2所示為硼砂濃度為10～30 mmol／L時對組分峰寬的影響。當硼砂濃度較低時，大黃酚峰形拖尾嚴重；隨著緩沖液濃度的增加，大黃酚峰寬逐漸減小，同時電滲流降低，組分的遷移時間增長；當硼砂濃度高于25 mmol／L時，基線噪聲較大，對檢出限有不利影響。綜合考慮峰形和基線噪聲的影響，選擇硼砂濃度為25 mmol／L。

圖2 硼砂濃度對分析物峰寬的影響Fig.2 Effect of buffer concentration on peak width

圖1 酸度對分析物峰寬的影響Fig.1 Effect of p H on peak width

2.3 SDS濃度的影響

圖3 SDS濃度對分析物遷移時間的影響Fig.3 Effect of SDS concentration on migration time

SDS濃度可影響組分的容量因子k′，從而對其遷移時間產生影響。SDS濃度對分析物遷移時間的影響見圖3。從圖3中可以看出，當SDS濃度超過40 mmol／L時，組分的遷移時間隨SDS濃度的增大而增大，并且基線噪聲明顯增強；而當SDS濃度小于40 mmol／L時，組分在管壁上存在吸附現象，峰形拖尾，且隨SDS濃度增大而逐步改善。這是由于緩沖液中的SDS可以通過疏水相互作用增強組分在膠束中的溶解，從而對其在管壁上的吸附產生一定抑制。綜合考慮遷移時間、檢出限和峰形，選擇SDS濃度為40 mmol／L。

2.4 乙醇體積分數的影響

有機溶劑可以改善組分在緩沖液中的溶解度，從而使遷移時間變短，乙醇對分析物遷移時間的影響見圖4。從圖4可以看出，當乙醇體積分數小于5%時，遷移時間隨乙醇體積分數增大而減小；但當體積分數繼續增大時，遷移時間又會增大，這是乙醇體積分數升高導致電滲流變小所致；當乙醇體積分數低于10%時，大黃酚由于管壁吸附而峰形拖尾；隨著乙醇體積分數的增加，大黃酚由于在緩沖液中溶解度增加而使其吸附得以抑制，拖尾逐步改善。綜合考慮遷移時間和峰形的影響，選擇乙醇的體積分數為10%。

2.5 分離電壓的影響

研究了分離電壓為8～18 k V時對組分遷移時間的影響。結果表明，組分遷移時間隨分離電壓升高而下降，但電壓超過15 k V后將使基線噪聲增大，影響檢出限。綜合考慮遷移時間和基線噪聲的影響，選擇分離電壓為15 k V。

圖4 乙醇體積分數對分析物遷移時間的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on migration time

2.6 線性范圍和檢出限

按照優化的電泳條件對不同質量濃度的標準工作溶液系列進行測定，可得二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚的標準曲線。對空白樣品測定后按3倍信噪比獲得了組分的檢出限，結果如表1所示。

表1 檢出限、工作曲線及其線性范圍Tab.1 Detection limits calibration curves and linear dynamic ranges

2.7 方法的日內和日間精密度

配制二苯乙烯苷、大黃素和大黃酚的標準溶液，于配制當日連續測定6次，可得日內遷移時間和峰面積的RSD值；對同一標準溶液在配制后6日內每日進行測定，可得日間遷移時間和峰面積的RSD值，見表2。

表2 精密實驗結果Tab.2 Precision results

2.8 樣品測定結果和加標回收率

按照樣品制備方法制備6份平行樣品，測得二苯乙烯苷的質量分數和相對標準偏差分別為17.6 mg／g和3.8%；大黃素的質量分數和相對標準偏差分別為1.19 mg／g和3.37%；大黃酚的質量分數和相對標準偏差分別為0.17 mg／g和2.97%。對照品和樣品的電泳圖如圖5所示。同時進行3個質量濃度級別的加標回收率測定，結果如表3所示。

圖5 對照品和樣品的電泳譜圖Fig.5 Electropherograms of the reference substance and the extract

表3 回收率實驗結果（n＝6）Tab.3 Results of recovery（n＝6）

3 結 語

樣品和加標回收率測定結果表明，本方法準確度和精密度較高，可滿足何首烏藥材質量控制的要求。

［1］ ZHANG L，XING Y，YE C F，et al.Learning-memory deficit with aging in APP transgenic mice of Alzheimer＇s disease and intervention by using tetrahydroxystilbene glucoside［J］.Behavioural Brain Research，2006，173（2）：246-254.

［2］ 衛培峰，焦晨莉，陳丹丹.何首烏現代藥理研究進展［J］.現代中醫藥（Modern Traditional Chinese Medicine），2004（1）：57-58.

［3］ 孫桂波，鄧響潮，郭寶江，等.何首烏蒽醌苷類化合物抗腫瘤作用研究［J］.中國新藥雜志（Chinese Journal of New Drugs），2008，17（10）：837-841.

［4］ 蔡麗芬，鐘國躍，張 倩，等.HPLC測定不同生長年限及采收期何首烏中二苯乙烯苷和蒽醌類成分的含量［J］.中國中藥雜志（China Journal of Chinese Materia Medica），2010（10）：1 221-1 225.

［5］ 庫爾班江.高效薄層光密度法測定牛黃解毒丸中大黃素的含量［J］.喀什師范學院學報（Journal of Kashgar Teachers College），2002，23（6）：43-45.

［6］ 盧建秋，高曉燕.HPLC-DAD法同時測定大黃中7個蒽醌類化合物的含量［J］.藥物分析雜志（Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis），2010，30（9）：1 636-1 641.

［7］ 孫小梅，馬 聰，吳士筠，等.大黃素的分光光度測定及其應用［J］.中南民族學院學報 （自然科學版）（Journal of South-Central University for Nationalities（Natural Sciences）），2001，20（4）：13-15.

［8］ 趙仁邦，葛 微.高效液相色譜法測定何首烏中大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的含量［J］.食品科學（Food Science），2001，22（2）：64-67.

［9］ BASKAN S，DAUT-ZDEMIR A，GUNAYDIN K，et al.Analysis of anthraquinones in rumex crispus by micellar electrokinetic chromatography［J］.Talanta，2007，71（2）：747-750.

［10］ 尚小玉，袁倬斌.β－環糊精修飾膠束電動毛細管色譜法測定大黃中有效成分［J］.分析化學（Chinese Journal of Analytical Chemistry），2002，30（7）：853-856.

［11］ 梁生旺，王 瑞，王淑美，等.膠束電動毛細管色譜法分離分析三七中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和三七皂苷R1［J］.藥物分析雜志（Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis），2007，27（2）：183-186.

［12］ 王 瑞，王淑美，梁生旺，等.膠束電動毛細管色譜法分離分析山茱萸中齊墩果酸和熊果酸［J］.中藥材（Journal of Chinese Medicinal Materials），2007，30（8）：946-950.

［13］ 肖美添，葉 靜，黃雅燕，等.膠束毛細管電泳測定枇杷葉中熊果酸和齊墩果酸的含量［J］.藥物分析雜志（Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis），2007，27（5）：724-727.

［14］ 董 敏，陳冠華，吳 嫻，等.膠束電動毛細管色譜法測定酸棗仁皂苷A和B［J］.中國天然藥物（Chinese Journal of Natural Medicines），2010，8（3）：208-211.

［15］ SHI S，LI W，LIAO Y，et al.Online concentration of aristolochic acidⅠandⅡin Chinese medicine preparations by micellar electrokinetic chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2007，1 167（1）：120-124.

［16］ 郭 濤，孫 沂，隋 因，等.膠束電動毛細管色譜法同時測定當歸中阿魏酸和腺苷的含量［J］.藥物分析雜志（Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis），2003，23（5）：348-351.

［17］ ZHU J，YU K，CHEN X，et al.Comparison of two sample preconcentration strategies for the sensitivity enhancement of flavonoids found in Chinese herbal medicine in micellar electrokinetic chromatography with UV detection［J］.Journal of Chromatography A，2007，1 167（2）：191-200.

［18］ 李 琦，胡廣林，徐曉琴，等.膠束電動毛細管色譜法測定穿心蓮中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯［J］.分析化學（Analchemical），2003，31（4）：451-454.

［19］ ZHOU L，ZHOU X，LUO Z，et al.In-capillary derivatization and analysis of ephedrine and pseudoephedrine by micellar electrokinetic chromatography with laser-induced fluorescence detection［J］.Journal of Chromatography A，2008，1 190（1／2）：383-389.

［20］ 翁前鋒，袁凱龍，張宏穎，等.膠束電動毛細管色譜安培檢測中藥馬齒莧中多巴胺和去甲腎上腺素［J］.色譜（Chromatography），2005，23（1）：18-21.

［21］ 尚小玉，袁倬斌.膠束電動毛細管色譜分離大黃中有效成分的研究［J］.中草藥（Chinese Traditonal Drug），2001，32（8）：691-692.

［22］ 張國慶，陳萬生.高效毛細管電泳法分離模擬混合的何首烏中7種蒽醌類成分的研究［J］.藥學實踐雜志（The Journal of Pharmaceutical Practice），1999，17（6）：352-354.

［23］ 袁海龍，張 純.高效毛細管電泳法測定何首烏中二苯乙烯苷的含量［J］.解放軍藥學學報（Pharmaceutical Journal of Chinese People＇s Liberation Army），2000，16（3）：151-154.

［24］ 楊會龍，劉寶友，王淑娟.幾種植物有效成分的提取及殺蟲活性研究［J］.河北科技大學學報（Journal of Hebei University of Science and Technology），2005，26（3）：208-211.

［25］ 劉紅梅，周慶霞，楊文玲.毛細管氣相色譜法測定銀杏葉中萜內酯含量［J］.河北科技大學學報（Journal of Hebei University of Science and Technology），2006，27（3）：209-213.

Determination of stilbene glycoside，emodin and chrysophanol in radix polygoni muliflori by micellar electrokinetic capillary chromatography

WU Xian，CHEN Guan-hua，WANG Kun，SHI Jie，WU Chuan-qin
（College of Food and Bioengineering，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

A new assay is developed by use of micellar electrokinetic capillary chromatography to determine stilbene glycoside，emodin and chrysophanol in radix polygoni muliflori.The factors affecting separation are optimized.The running buffer contains 25 mmol／L borax，40 mmol／L sodium dodecyl sulfate and 10%ethanol，and its p H value is adjusted to 9.5.Under the optimum conditions，the linear dynamic range is 2.0～1 000 mg／L for stilbene glycoside，5.2～260 mg／L for emodin and 4.5～225 mg／L for chrysophanol.The limits of detection are 1.10，0.29 and 0.43 mg／L for stilbene glycoside，emodin and chrysophanol，respectively.The average recoveries are 98.8%，98.8%and 100.7%for stilbene glycoside，emodin and chrysophanol.The assay meets the determination requirement of stilbene glycoside，emodin and chrysophanol in radix polygoni muliflori，and can be applied to quality control of the raw material of radix polygoni muliflori.

micellar electrokinetic capillary chromatography；radix polygoni muliflori；stilbene glycoside；chrysophanol；emodin

R284.1；O657.8

A

1008-1542（2011）05-0426-05

2011-05-23；

2011-09-10；責任編輯:張士瑩

教育部高等學校博士學科點專項科研基金資助項目 （20093227110010）；江蘇大學科研基金資助項目 （08JDG001）；江蘇省高校優勢學科建設工程資助項目

吳 嫻（1986-），女，安徽馬鞍山人，碩士研究生，主要從事食品安全檢測方面的研究。

陳冠華教授。E-mail：chengh＠ujs.edu.cn