氯化鈉促進溶菌酶聚集機制的分子動力學研究

關 婧，李 輝，鄒志遠，何劍為，宋有濤

（遼寧大學生命科學學院，遼寧 沈陽 110036）

氯化鈉促進溶菌酶聚集機制的分子動力學研究

關 婧，李 輝，鄒志遠，何劍為，宋有濤

（遼寧大學生命科學學院，遼寧 沈陽 110036）

氯化鈉能夠在一定的條件下促進溶菌酶發生聚集，但其具體的作用機制目前還尚不明確.采用分子動力學模擬的方法研究了雞溶菌酶單體在含500mmol／L NaCl和不含NaCl兩種體系中的結構變化.模擬的結果表明：NaCl能夠使溶菌酶聚集關鍵區域（40～110位殘基）內二硫鍵cys76-cys94的結合強度減弱，同時破壞了該區域內的氫鍵網絡，從而導致了蛋白結構的不穩定性；另一方面，NaCl也促使疏水核心發生了一定的擴張，使疏水核心內氨基酸殘基的結合變得更加松散，從而促進了溶菌酶分子間的相互作用.

溶菌酶；氯化鈉；淀粉樣聚集；分子動力學模擬

近年來，許多蛋白質錯誤折疊導致的疾病，如阿爾茨海默病、瘋牛病、帕金森氏病等，已經越來越被關注，它們的發生均與蛋白質的淀粉樣纖維化沉積有關，但蛋白質淀粉樣纖維化的機制目前尚不清楚［1－2］.已有研究結果表明，這些蛋白的成纖維傾向除了與其序列和結構有一定的關系外，更重要的是與蛋白質所處的環境條件密切相關.生物體體液中的各種鹽離子可通過與蛋白質的相互作用，使蛋白質分子能夠保持正確的結構.一旦體液中的離子強度發生變化，蛋白質就可能產生錯誤折疊而生成淀粉樣聚集體［3］.

溶菌酶廣泛存在于鳥類的蛋清和哺乳動物的淚液、唾液、血漿、乳液、胎盤以及體液、組織細胞內，以蛋清中含量最豐富（約0.3%）.迄今在世界上發現的兩種由溶菌酶突變導致的家族遺傳性淀粉樣變性病，患者主要在內臟中都產生了大量淀粉樣蛋白的沉淀物，其致死原因是腎損傷或肝出血［4］.溶菌酶蛋白家族具有高度的序列和結構保守性.作為該超家族的成員，雞卵清溶菌酶蛋白同樣具有淀粉樣纖維化傾向［5］.以雞卵清溶菌酶作為模型，近年來美國的Clyston等通過酶交聯的方法比較分析了酸性條件下NaCl對溶菌酶聚集的影響，結果表明，該蛋白從3% （500mmol／L）的NaCl梯度開始出現明顯的聚集體并隨著離子強度的增加而增多［6］.另外，李文涓等采用熒光光譜法發現，在長時間熱脅迫的情況下，NaCl可促進溶菌酶分子的聚集而纖維化［3］.戴國亮等通過動態光散射法研究不同濃度NaCl對溶菌酶生長晶體的影響時發現，較高濃度的NaCl可以誘導溶菌酶在溶液中形成較大的聚集體［7］.這暗示著NaCl可能通過某種機制促進溶菌酶的構象改變，進而誘導溶菌酶發生了分子間聚集.但通過常規實驗的方法對相關聚集的分子機制是很難探明的.

較傳統實驗方法而言，基于測定的蛋白質三級結構和牛頓力學、量子力學的分子動力學模擬（molecular dynamics simulation）能夠利用計算機強大的計算能力模擬再現蛋白質納秒數量級的結構變化過程，并在原子水平上提供有關蛋白結構變化的詳細信息，可用于輔助并指導傳統實驗的研究.目前，這種技術已被逐漸應用于蛋白質錯誤折疊疾病分子機制的研究中［8－9］.本研究通過模擬分析酸性條件下500mmol／L NaCl對雞卵清溶菌酶單體穩定性的影響，從結構動力學的角度深入探討了NaCl促進溶菌酶聚集的分子機制，對于探索蛋白質錯誤折疊疾病的機制，理解蛋白質在生命過程中的行為具有重要意義.

1 模擬方法和條件

本文采用Gromacs 4.0［10］軟件將雞卵清溶菌酶模型在含500mmol／L NaCl和不含NaCl兩種體系中分別進行10ns分子動力學模擬，使用的力場為GROMDS9643a1，模擬條件為溫度25℃，pH＝1.0.初始結構文件來自于RCSB數據庫射線衍射三維坐標文件（PDB編號1GXV）［11］.確定模擬體系的溫度耦合采用“Berendsen-thermostat”法，耦合常數為0.1ps；壓力耦合采用“Parrinello-Rahman”方法，耦合常數為0.5ps，參照壓力為1.0×105Pa［12］.采用標準立方盒包裹模型及其他分子，晶體置于盒子中心，選擇溶質原子到盒子壁的距離為1nm以保證蛋白質有足夠的構象變化空間.水溶液環境下采用SPC模型（含29 174個水分子），加入18個Cl—分子使體系電荷量達到平衡.然后在其中一個體系內加入500mmol／L的NaCl.同時，為了減少結構文件轉換過程中氫原子被自動加上后，由于粒子與粒子距離過緊而引起不合理的碰撞，將體系以最陡下降法（steep）優化1 000步的能量.模擬體系中的遠程范德華力作用距離取1.4nm，經典相互作用使用球型截斷半徑“cut-off”方法計算.體系在所有方向上采用周期性邊界條件，時間步長為2fs，模擬結果用VMD（visual molecular dynamics）［13］軟件進行了系統可視化分析.

2 結果

2.1 模擬過程中溶菌酶RMSD值的比較分析

RMSD（root mean square deviation，均方根偏差）可用來測量兩個進行比對的蛋白質相同位點上的氨基酸殘基碳原子之間的距離，是測定蛋白質骨架變化指標衡量模擬過程中蛋白是否達到穩定結構的重要參數［14］.RMSD值的大小直接反映了蛋白質結構的穩定性.如圖1所示，溶菌酶單體在500mmol／L的NaCl模擬體系中整體結構的RMSD值在5ns左右達到平衡（約0.30nm）.與不含NaCl的模擬體系相比，其平均值整體上要高0.05nm左右.這說明了NaCl使得溶菌酶單體的穩定性變差，與先前其他研究者在體外生化實驗體系中觀察到的現象是一致的.

2.2 模擬后溶菌酶的結構比對分析

RMSF（root mean square fluctuation，均方根漲落）是蛋白體系最終原子位置同參考位置的比較，它可以通過蛋白中各個氨基酸相對于平均結構的位置偏差來計算蛋白質二級結構變化的劇烈程度［13］.如圖2（A）所示，500mmol／L的NaCl模擬體系中溶菌酶的氨基酸殘基整體變化幅度均大于不含NaCl的模擬體系，其中變化比較顯著的區域是第40～110位殘基.這與通過分子生物學實驗得到的結論，即溶菌酶上觸發蛋白聚集的關鍵區域為57～107位殘基基本上是一致的［15］.因此，我們選取了多肽片段40～110位殘基進行了結構比對（見圖2B）.結果顯示，在添加NaCl的模擬體系中溶菌酶的α3片段發生了部分解旋，其螺旋殘基從13個降為8個，而該區域的環狀（loop）結構和β片層結構卻分別增加了4.3%和7.1%，表明了片段40～110區域結構在NaCl存在的情況下具有較高的柔性，另外這些二級結構的變化也是典型的蛋白質淀粉樣聚集時的特征.

圖1 RMSD值隨模擬時間的變化

圖2 （A）RMSF值隨模擬時間變化及（B）模擬后結構比對

2.3 關鍵區域中二硫鍵的分析

溶菌酶結構中主要存在4個二硫鍵.前期的分子生物學實驗結果表明，兩個位于關鍵區域內的二硫鍵cys64-cys80和cys76-cys94在蛋白成纖維過程中起了重要作用，而其他兩個二硫鍵并沒有參與纖維的形成［15］.因此，我們定量分析了溶菌酶二硫鍵cys64-cys80和cys76-cys94在含鹽和不含鹽兩種模擬體系中的變化情況（見圖3）.在分子動力學模擬中，一般認為兩個半胱氨酸之間的距離小于0.4nm為二硫鍵的形成狀態，而大于0.4nm的為二硫鍵斷裂狀態［16］.模擬的結果顯示，二硫鍵cys64-cys80在兩種模擬體系中均未發生斷裂（見圖3A）.值得注意的是：NaCl使得二硫鍵cys76-cys94從4ns開始表現出明顯的斷裂趨勢，這種趨勢一直延續到模擬結束，而不含NaCl的模擬體系中溶菌酶的二硫鍵cys76-cys94并未發生斷裂（見圖3B）.由于本模擬體系中的二硫鍵沒有被保護，所以并不能確定推導出生化實驗中溶菌酶的二硫鍵cys76-cys94是斷裂的，但是這個結果暗示著溶液中NaCl可能通過削弱二硫鍵cys76-cys94的強度，使得溶菌酶的構象容易發生轉換，從而降低其單體穩定性，最后形成分子間聚集.

圖3 二硫鍵距離隨時間的變化

2.4 關鍵區域中氫鍵存活時間的分析

氫鍵作為一種非共價結合作用在維持蛋白的結構穩定性方面起著重要的作用.近年來許多研究發現了蛋白質的淀粉樣聚集與氫鍵網絡破壞密切相關［17］.因此，我們分析了多肽片段40～110位殘基中的氫鍵數量及存活時間（見圖4）.結果表明，雖然添加的NaCl模擬體系中溶菌酶氫鍵的數量略高于不含NaCl體系中的氫鍵數量（234∶212），但是從整個模擬過程中大于95%的氫鍵存活時間來看，不含NaCl的模擬體系中的氫鍵數為21個，而NaCl模擬體系中的氫鍵數僅為14個.由于氫鍵的存活時間相對于單純的數量對于蛋白結構的穩定性更有直接意義，這個結果說明了NaCl的加入可能會導致溶菌酶關鍵區域內氫鍵網絡的破壞，從而降低其單體的穩定性，趨向于分子間的聚集.

圖4 氫鍵隨模擬時間的變化

2.5 溶菌酶疏水核心的比較分析

蛋白質的疏水核心是維持蛋白結構穩定性的重要組成.此前關于另一種淀粉樣蛋白胱抑素（cystatin）的分子動力學研究表明，其疏水核心的擴張是形成胱抑素分子間聚集的重要原因［9，18］.因此，本研究分析了NaCl對溶菌酶疏水核心穩定性的影響.雞溶菌酶疏水核心結構主要是由15個疏水殘基組成，包括β區域的Ile-55，Leu-56，Ile-58和α區域的 Leu-8，Met-12，Trp-28，Ala-31，Ala-32，Phe-34，Phe-38，Ala-95，Ile-98，Ala-107，Trp-108，Ala-110.通過比較疏水核心的溶劑可及表面積（SASA）不僅可以說明疏水核心內氨基酸殘基結合的緊密程度，而且還可確定蛋白質整體結構的穩定性［19］.如圖5（A）所示，溶菌酶疏水核心在NaCl模擬體系中的溶劑可及表面積整體要高于其在不含NaCl模擬體系的數值，這暗示著NaCl促使溶菌酶的疏水核心氨基酸殘基有向外擴張的趨勢.模擬過程中疏水核心內具體每個氨基酸殘基的位移疊加結果顯示，Trp28，Phe38，Ala107，Trp108，Ala110在NaCl模擬體系中均向外發生了顯著地擴張（見圖5C），而這些氨基酸殘基在不含NaCl的模擬體系中并未發生明顯地偏移（見圖5B）.

圖5 疏水核心SASA值隨模擬時間的變化（A）及疏水核心位移疊加圖

3 結論

綜上所述，我們通過對雞卵清溶菌酶蛋白質單體結構模型的分子動力學模擬的研究，提出了NaCl促進溶菌酶的聚集可能的分子機制：一方面NaCl使得溶菌酶聚集關鍵區域（40～110位殘基）內二硫鍵cys76-cys94的結合強度減弱，同時破壞了該區域內的氫鍵網絡，從而導致了蛋白結構的不穩定性；另一方面，NaCl促使疏水核心發生擴張，使得疏水核心內氨基酸殘基的結合變得更加松散，從而促進了溶菌酶分子間的相互作用.這對于深入研究溶菌酶引發的蛋白質錯誤折疊疾病的發病機制有重要的促進意義，雖然本分子動力學模擬的結論還有待更多的分子生物學和生物化學實驗的證據支持.此外，本研究中所采用的研究方法，對有關這一類由于淀粉樣纖維化沉積引起的蛋白質錯誤折疊疾病的研究及治療也提供了一個新的思路.

［1］ ROSS C A，POIRIER M A.Protein aggregation and neurodegenerative disease［J］.Nature Med，2004，10：10-17.

［2］ STEFANI M.Protein misfolding and aggregation：new examples in medicine and biology of the dark side of the protein world［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1739（1）：5-25.

［3］ 李文涓，李芳，唐燕紅，等.溶液中金屬鹽對溶茵酶高級結構的影響［J］.化學應用與研究，2009，21（3）：423-426.

［4］ GILLMORE J D，BOOTH D R，MADHOO S，et al.Hereditary renal amyloidosis associated with variant lysoayzme in a large English family［J］.Nephrol Dial Transplant，1999，14（11）：2639-2644.

［5］ PEPYS M B，HAWKINS P N，BOOTH D R，et al.Human lysozyme gene mutations cause hereditary systemic amyloidosis［J］.Nature，1993，362（6420）：553-557.

［6］ CLAYTON L H，JOHN R C，AMANDA M B，et al.Supersaturated lysozyme solution structure studied by chemical crosslinking［J］.Acta Cryst，2005，61（6）：813-818.

［7］ 戴國亮，胡文瑞.NaCl對液－液擴散法生長溶菌酶晶體的影響［J］.化學學報，2003，61（4）：520-545.

［8］ HANSSON T，OOSTENBRINK C，VAN GUNSTEREN W.Molecular dynamics simulations［J］.Curr Opin Struct Biol，2002，12（2）：190-196.

［9］ YU Y，WANG Y，HE J，et al.Structural and dynamic properties of a new amyloidogenic chicken cystatin mutant I108T［J］.J Biomol Struct Dyn，2010，27（5）：0739-1102.

［10］ HESS B，KUTZNER C，LINDAHL E.GROMACS 4：algorithms for highly efficient，load-balanced，and scalable molecular simulation［J］.J Chem Theory Comput，2008，4（3）：435-447.

［11］ REFAEE M，TEZUKA T，AKASAKA K.Pressure-dependent changes in the solution structure of hen egg-white lysozyme［J］.Mol Biol，2003，327（4）：857-65.

［12］ PARRINELL O M，RAHMAN A.Polymorphic transitions in single crystals：a new molecular dynamics method［J］.J Appl Phys，1981，52（12）：7182-7190.

［13］ HUMPHREY W，DALKE A，SCHULTEN K.VMD：visual molecular dynamics［J］.J Mol Graph，1996，14（1）：27-38.

［14］ EASTWOOD M P，HARDIN C，LUTHEY-SCHULTEN Z.Evaluating protein structure-prediction schemes using energy landscape theory［J］.IBM J Res Dev，2001，45：475-497.

［15］ FRARE E，POLVERINO DE LAURETO P，ZURDO J，et al.A highly amyloidogenic region of hen lysozyme［J］.J Mol Biol，2004，340（5）：1153-1165.

［16］ KOHLER P，KECK-GASSNMEIER B，WIESER H，et al.Molecular modeling of the N-terminal regions of high molecular weight glutenin subunits 7and 5in relation to intramolecular disulfide bond formation［J］.Cereal Chem，1997，74（2）：154-158.

［17］ BERNARD G，GUILBERT C，DAVID P.Unfolding of hen egg lysozyme by molecular dynamics simulations at 300K：insight into the role of the interdomain interface［J］.Proteins，2000，41（1）：58-74.

［18］ JANOWSKI R，KOZAK M，JANKOWSKA E，et al.Human cystatin C，an amyloidogenic protein，dimerizes through threedimensional domain swapping［J］.Nat Struct Biol，2001，8（4）：316-320.

［19］ MILLER S，JANIN J，LESK A M，et al.Interior and surface monomeric proteins［J］.J Mol Biol，1987，196（3）：641-656.

Mechanism study of sodium chloride on lysozyme aggregation investigated by molecular dynamics simulation

GUAN Jing，LI Hui，ZOU Zhi-yuan，HE Jian-wei，SONG You-tao
（College of Life Sciences，Liaoning University，Shenyang 110036，China）

Sodium chloride（NaCl）could induce lysozyme aggregation under some conditions，but the detail mechanism has been poorly understood.In this study，performed 10ns molecular dynamic simulations to investigate the structure changes of chicken lysozyme monomer when treated with 500 mmol／L NaCl.The simulation results indicated that NaCl could weaken the disulfide bond cys76-cys94 as well as the hydrogen bonding network in the aggregation critical region，which might lead instability of the lysozyme structure.In addition，results also showed that the hydrophobic core had an apparent expanding tendency when treated with NaCl，which might promote the intermolecular interactions between lysozyme monomers.

lysozyme；sodium chloride；amyloid aggregation；molecular dynamics simulation

Q 71

180·37

A

1000-1832（2011）03-0117-05

2011-04-29

國家自然科學基金資助項目（30970152）；遼寧省教育廳優秀人才基金資助項目（2009R26）.

關婧（1985—），女，碩士研究生；通訊作者：宋有濤（1973—），男，博士，教授，遼寧省動物資源與疫病防治重點實驗室主任，主要從事分子生物學研究

方 林）