毛節纈草抗抑郁和抗腫瘤活性組分的研究

趙麗輝，張一折，杜 娟，韓德明，田 堅，孫秀平

（1.長春理工大學國際納米光子學與生物光子學聯合研究中心，吉林長春 130022；2.鄭州大學生物工程系，河南鄭州 450001）

毛節纈草抗抑郁和抗腫瘤活性組分的研究

趙麗輝1，張一折2，杜 娟1，韓德明1，田 堅1，孫秀平1

（1.長春理工大學國際納米光子學與生物光子學聯合研究中心，吉林長春 130022；2.鄭州大學生物工程系，河南鄭州 450001）

對毛節纈草乙醇滲漉提取的濃縮物和藥材蒸餾獲得的水提液中的活性組分進行了分析.分別加水混懸后，通過小鼠體內實驗檢測了抗抑郁活性組分；醇提濃縮物加水混懸后用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取、濃縮，各萃取組分通過MTT比色法測定了體外培養的Hella細胞、骨髓瘤細胞的增殖抑制率.實驗結果表明：纈草水提取物具有抗抑郁的活性，纈草乙醇提取物乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相及萃取后水相對細胞增殖抑制作用均不明顯；而提取物的氯仿萃取相抗腫瘤作用明顯，且表現出一定的劑量相關性.

纈草；抗腫瘤；抗抑郁；活性組分

纈草（ValerianaofficinalisL.）為敗醬科纈草屬多年生野生草本植物，多數可作藥用，根及根莖是主要入藥部位.在中國和歐洲，該屬植物具有悠久的藥用歷史，其成分多種多樣，且隨著氣候及生態環境的不同而有所不同.纈草主要含環烯醚萜、倍半萜、生物堿和黃酮4大類型化學成分［1－2］，其中一種新類型天然產物環烯醚酯類物質，經藥理研究表明具有鎮靜作用，同時還具有細胞毒性和抗腫瘤等多種生物活性［3－4］.本文對纈草的化學組分進行了抗抑郁和抗腫瘤活性組分活性研究，以為制備毒副作用小甚至無毒副作用的新型抗抑郁、抗腫瘤藥物提供理論支持.

目前治療抑郁癥、腫瘤的藥物服后不僅有不良的反應，還可產生多種危害，長期服用，可引起依賴性和耐受性，有的還具有成癮性.這就迫切需要盡快開發研制出療效確切，既能抑郁癥、殺傷腫瘤細胞，且毒副作用又小的國產抗抑郁癥、抗腫瘤植物藥［5］.中藥抗抑郁癥、抗腫瘤作用具有多靶點、多環節、多效應的特點，可作用于治療抑郁癥、腫瘤發生、發展的多個環節；同時其毒副作用低，能提高機體免疫力，不易產生耐藥性，為近年來研究的熱點［6－7］.纈草的活性成分也正是我們要篩選的抗抑郁癥、抗腫瘤藥物之一.

1 實驗部分

1.1 材料和試劑

乙醇溶液（95%）購于北京化工廠；PBS液（無鈣、鎂離子），0.5%胰蛋白酶，3%谷氨酰胺，培養液（RPMI1640＋10%小牛血清），MTT（Sigma，5 mg／m L），甲瓚溶解液（10%十二烷基硫酸鈉），吐溫80等試劑均購于鼎國生物技術有限公司；安樂片由四川琦云藥業有限責任公司出品；Hella細胞、骨髓瘤細胞，本實驗室保存.ICR小鼠80只（雌雄各半，體重18～22 g），由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供.

1.2 纈草的提取

首先將纈草根粗粉，用15倍（質量）95%乙醇滲漉提取，收集滲漉液，在78℃以下減壓回收乙醇，得膏狀物；另取纈草根加水蒸餾5 h，將藥渣水相過濾、減壓濃縮，得水提濃縮液［8］.

1.3 動物實驗

實驗選取自主活動次數相近的小鼠80只，隨機分為8組，每組10只，雌雄各半，分籠飼養.其中：

Ⅰ組為陰性對照組，每日以生理鹽水0.02 m L／g灌胃；

Ⅱ組為陽性對照組，每日以抗抑郁藥安樂片20 mg／kg灌胃給藥；

Ⅲ，Ⅳ組分別以纈草醇提取物100 mg／kg以及200 mg／kg灌胃給藥；

Ⅴ，Ⅵ組分別以纈草水提取物100 mg／kg以及200 mg／kg灌胃給藥；

Ⅶ組以纈草揮發油0.5μL／g灌胃給藥.

每個對照組均需另加劑量為10 m L／L的乳化劑吐溫80，以利于溶解.連續給藥10 d.

1.4 纈草乙醇提取物的萃取

稱取纈草乙醇提取物500 g，分3份分別混懸于500 m L水中，分別用適量的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，各萃取3次.合并萃取液，用旋轉蒸發儀依次回收萃取液，得氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物和萃取后剩余水相.

1.5 MTT法

將傳代腫瘤細胞懸液離心后，用含10%小牛血清的RPMI1640重懸配成單個細胞懸液，調整細胞懸液濃度，收集對數期細胞，每孔加入100μL，鋪板使待測細胞密度為1 000～10 000個／孔，隨即加入不同濃度的待試藥液.陽性對照組加入5－氟尿嘧啶（5－Fu），溶劑組加0.9%NaCl溶液，容積均為20μL.培養液中藥物終濃度分別為0.05，0.1，0.15，0.02 g／L.37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養5 d后，每孔加入MTT溶液20μL，孵育4 h后每孔加入DMSO 150μL，在酶聯免疫檢測儀570 nm（630 nm校準）處測量各孔的吸光值（D（570）值）.

配制濃度為5 mg／m L的MTT：稱取MTT 0.5 g，溶于100 m L的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，4℃避光保存.用酶標儀檢測結果，為了保證實驗結果的線性，MTT的吸光度最好在0～0.7范圍內，用酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量［9］.

2 結果與分析

2.1 纈草提取物對小鼠強迫游泳不動時間的影響

動物持續灌胃給藥11 d，至第11天時，給藥30 min后，將小鼠放入水深為10 cm、高20 cm、直徑10 cm的圓柱形玻璃缸中，每缸一只，水溫25℃，小鼠游泳2 min后，立即開始觀察，觀察持續5 min，記錄此5 min內小鼠在水中停止掙扎、或呈漂浮狀態、或僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面的持續時間（不動時間），結果見表1.

表1 提取物對小鼠游泳不動時間的影響

表1顯示，Ⅲ，Ⅴ與Ⅰ（陰性對照組）比較無顯著性差異（P＞0.05）；Ⅱ，Ⅳ，Ⅵ，Ⅶ與Ⅰ比較有顯著性差異（P＜0.05）.由此可見，纈草醇提物低劑量組、水提物低劑量組對小鼠強迫游泳不動時間無顯著影響；纈草醇提物高劑量組、水提物高劑量組均能縮短小鼠強迫游泳不動時間.

2.2 纈草提取物對小鼠懸尾不動時間的影響

動物灌胃給藥12 d，至第12天給藥30 min后，測懸尾不動時間：將小鼠尾部后1／3處用鐵夾固定，懸吊于鐵架臺上，使其頭部向下懸掛，出現不動時用秒表計時，累計6 min內不動時間，結果見表2.

表2顯示，Ⅲ，Ⅴ與Ⅰ（陰性對照組）比較無顯著性差異（P＞0.05）；Ⅱ，Ⅳ，Ⅵ，Ⅶ與Ⅰ比較有顯著性差異（P＜0.05）.由此可見，纈草醇提物低劑量組、水提物低劑量組對小鼠懸尾不動時間無顯著影響；纈草醇提物高劑量組、水提物高劑量組均能縮短小鼠懸尾不動時間.

表2 提取物對小鼠懸尾不動時間的影響

綜合表1、表2可知，纈草醇提物高劑量組、水提物高劑量組能縮短小鼠強迫游泳及懸尾不動時間，有抗抑郁作用，具有較大的研究價值.

2.3 纈草乙醇提取物抗腫瘤實驗

顯微鏡下觀察，培養后期溶劑組腫瘤細胞活躍增殖，全視野密集均勻分布，5－Fu和醇提氯仿層萃取物的腫瘤細胞明顯稀疏，部分細胞破碎壞死，尤以大劑量組為甚.加入MTT后，溶劑組鏡下可見大量放射叢狀結晶，5－Fu和醇提氯仿層萃取物組的結晶隨濃度加大腫瘤細胞明顯減少.各試劑組在不同濃度下的光密度值見表3及表4.

表3 MTT比色法測定纈草提取物對Hella細胞的增殖影響

表4 MTT比色法測定纈草提取物對骨髓瘤細胞的增殖影響

從表3可以看出，纈草乙醇提取物氯仿萃取相與溶劑組（陰性對照組）比較有顯著性差異（P＜0.05）；纈草乙醇提取物乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相及萃取后水相與溶劑組比較無顯著性差異（P＞0.05）；纈草乙醇提取物氯仿萃取相與5－Fu組（陽性對照組）比較無顯著性差異（P＞0.05）.可見纈草乙醇提取物氯仿萃取相具有抗Hella細胞活性.

從表4可以看出，纈草乙醇提取物氯仿萃取相與溶劑組（陰性對照組）比較有顯著性差異（P＜0.05）；纈草乙醇提取物乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相及萃取后水相與溶劑組比較無顯著性差異（P＞ 0.05）；纈草乙醇提取物氯仿萃取相與5－Fu組（陽性對照組）比較無顯著性差異（P＞0.05）.可見纈草乙醇提取物氯仿萃取相具有抗骨髓瘤細胞活性.

3 討論

小鼠強迫游泳不動實驗和小鼠尾懸吊實驗屬于行為絕望實驗，被廣泛用于抗抑郁藥的篩選和評價［10－11］.本研究采用了這兩種抗抑郁動物模型，以觀察纈草乙醇提取物、纈草水提取物對小鼠抑郁狀態行為的影響，結果顯示纈草醇提物、水提物均不同程度地縮短了小鼠不動時間，其中纈草水提物抗抑郁作用顯著.纈草醇提物高劑量組、水提物高劑量組能縮短小鼠強迫游泳及懸尾不動時間，有抗抑郁作用，具有極大的研究價值.

采用MTT比色法［12－13］，以人體宮頸癌細胞、骨髓瘤細胞為靶細胞，對纈草乙醇提取物各萃取相的抑制腫瘤細胞增殖的作用進行了檢測，結果顯示纈草乙醇提取物的乙酸乙酯萃取層、正丁醇萃取層和剩余水層對體外培養的宮頸癌細胞、骨髓瘤細胞增殖抑制作用均不明顯；氯仿萃取相抗腫瘤作用顯著，劑量在0.05～0.20 g／L之間抑制作用明顯.

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Studies of activities component of antidepressie and anticancer onValerianaofficinalisL.

ZHAO Li－hui1，ZHANG Yi－zhe2，DU Juan1，HAN De－ming1，TIAN Jian1，SUN Xiu－ping1

（1.International Joint Research Center for Nanophotonics and Biophotonics，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022，China；2.Bioengineering Department，Zhengzhou University，Zhengzhou 540001，China）

In this report，obtained ethanol concentrate by using percolation，and waterextract by distillation.Add water after suspension，detect antidepressant active component by the mice in vivo.Using chloroform，ethyl acetate，andn－butanol ordinal extraction，ethanol concentrate add water after suspension，get extract and extraction surplus water phase concentrate.Each extraction is determinede on inhibition rate of Hella cells and mylenoma in vitro by MTT colorimetric.The result shows that water extract has antidepressant activity，ethyl acetate extract phase，n－butanol extractphase and surplus water phase of ethanol extractive has not a significant action in inhibition of cell proliferation.The CHCl3extract phase of ethanol extractive is effective with tumor，and it also shows some of the dose correlation.

ValerianaofficinalisL.；anti－tumor；antidepressie；active component

R 284

360·4010

A

1000－1832（2011）03－0122－04

2011－04－12

吉林省科技發展計劃項目（20070902－02）.

趙麗輝（1966—），女，博士，教授，主要從事生物化學和分子生物研究.

方 林）