食蟹猴心血管病風險因素與心血管病相關基因在外周血白細胞表達的相關性

夏機良, 郝香芬, 曾小明, 靳麗莎, 周 彤, 李學家, 孫云霄,饒軍華, 劉曉明, 彭白露,*

(1. 廣東省昆蟲研究所, 廣東 廣州 510260; 2. 廣東藍島生物技術有限公司, 廣東 廣州 510555)

食蟹猴心血管病風險因素與心血管病相關基因在外周血白細胞表達的相關性

夏機良1, 郝香芬1, 曾小明2, 靳麗莎1, 周 彤2, 李學家1, 孫云霄1,饒軍華1, 劉曉明1, 彭白露1,*

(1. 廣東省昆蟲研究所, 廣東 廣州 510260; 2. 廣東藍島生物技術有限公司, 廣東 廣州 510555)

研究心血管病風險因素和心血管病相關基因表達的相關性有助于心血管病風險預警和早期診斷研究。該文采用溫和的動脈粥樣硬化膳食(0.053 mg膽固醇/千焦、40 %的能量來源于脂肪)喂養中老年雄性食蟹猴(Macaca fascicularis)(12個月), 根據傳統心血管病風險因素篩選低、高風險食蟹猴, 然后采用熒光定量PCR技術檢測113個心血管病相關基因在正常組、低風險和高風險組食蟹猴外周血白細胞內的表達差異。結果在食蟹猴外周血白細胞中共檢測到65個心血管病相關基因, 其中低、高風險組有16個基因相對于正常組表達上調(P＜0.05), 19個基因表達下調(P＜0.05), 另外, 還有 15個基因表達模式特異(P＜0.05)。此外, 還檢測到 42個心血管病相關基因在人和食蟹猴外周血白細胞內均有效表達, 其中22個基因在兩者之間表達模式一致。上述結果為進一步研究心血管病風險預警和早期診斷指標, 縮小了基因遴選范圍。

心血管病; 風險預警; 早期診斷; 食蟹猴; 熒光定量PCR; 外周血白細胞

美國國家膽固醇教育計劃(National Cholesterol Education Program, NCEP)將心血管病危險性分為四個級別(Brewer et al, 2004)：高度危險、中高度危險、中危險、低危險。其中中高以下患者大部分沒有臨床癥狀, 且診斷方法不成熟, 只能通過傳統的心血管病風險因素對其進行風險預測。

目前, 研究人員已開發出多種心血管病預測方法(Lisa et al, 2001; Carol et al, 2007; Cobain et al,2008), 且已廣泛應用于臨床。年齡、體重指數(body mass index, BMI)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、甘油三酯(triglyceride, TG)、血糖(glucose, GLU) 和高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol, HDL-C)等心血管病風險因素均被應用于心血管病風險預測(Lisa et al,2001; Carol et al, 2007; Cobain et al, 2008)。當血清HDL-C濃度大于1.81 mmol/L(60 mg/dL)時是一個負風險因素, 可抵消掉一個正風險因素; 濃度小于1.21 mmol/L(40 mg/dL)時是一個正風險因素(Li,2002)。心血管病風險預測模型缺陷也很明顯, 一是前瞻性不夠; 二是準確性不高。因此, 尋找更多的心血管病診斷指標對于心血管病早期預防意義重大。

外周血白細胞取材方便, 對機體無創傷性傷害,是一種理想的臨床診斷材料。已有研究人員發現隨著血脂變化白細胞內相關基因也出現表達變化(Dempsey et al, 2007)。我們采用實時熒光定量PCR方法檢測113個心血管病相關基因在食蟹猴外周血白細胞中的表達狀態。期望找到一些表達量隨心血管病的危險程度變化而變化的基因，這些基因可作為心血管病風險預測和早期診斷的候選指標。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

中老年雄性食蟹猴 35只由華南靈長類研究開發中心提供, 其中 30只采用溫和的動脈粥樣硬化膳食(0.053 mg膽固醇/千焦、40 %的能量來自于脂肪)單籠喂養, 另外5只采用普通飼料喂養作為正常對照。5個正常男性和10個心血管疾病高風險男性患者血液由廣州市花都區中醫院提供(均自愿)。所有飼料均由廣州飼料研究所生產, 置于4 ℃冷庫中保存, 保質期2個星期。紅細胞裂解液自己配制(1.6 mmol/L EDTA, 10 mmol/L KHCO3, 153 mmol/L NH4Cl, pH 7.4), Trizol 試劑購自 Invitrogen 公司,SYBR? Green染料及SYBR? Premix Ex TaqTM購自 TaKaRa公司、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix由TransGen Biotech公司提供,引物合成和測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 外周血血清和白細胞提取以及 RNA抽提和cDNA制備 實驗猴禁食18 h, 然后使用10 mL無菌注射器于股靜脈取血8 mL。其中5 mL血置于抗凝管中(含EDTA 1 g/L), 用于提取白細胞。其余3 mL血置于普通真空管中, 用于提取血清。外周血白細胞提取采用紅細胞裂解液(Dempsey et al, 2007)。采用Trizol提取白細胞RNA(Chomczynski & Sacchi,1987), 然后通過凝膠電泳檢測RNA的質量。取大約 0.5 μg RNA, 采用兩步法, 用 EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix將RNA逆轉錄成cDNA, 將制備好的cDNA置于?20 ℃保存備用。將普通真空管中的血液室溫靜置30 min, 然后4 ℃,3 000 g/ min離心15 min(eppendorf 5810)，將上層血清取出, 用于生化指標檢測。

1.2.2 血液生化指標檢測 實驗猴血清提取出來后立刻送到廣州醫藥工業研究院(2004年通過了國家食品藥品監督管理局 GLP檢查認證)檢測血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和GLU的濃度。

1.2.3 心血管病相關基因和引物設計 根據已有的人心血管病 PCR芯片和最新文獻報道, 挑選出113個心血管病相關基因。目前食蟹猴全基因組序列還沒公布。所以, 我們以恒河猴心血管病相關基因的mRNA序列作為引物設計模板。同時, 為了方便以后應用于臨床, 我們將所有引物序列設計在人和恒河猴mRNA同源區域。以GAPDH和RPL13A作為內參(Chen et al, 2005; Anton et al, 2007), 所有心血管病相關基因和內參引物擴增出的核酸序列長度在150～250 bp之間, 且擴增效率基本一致。113個基因按功能分類, 如下所示：免疫應答分子：CCR2、IL10、IL18、IFNG、IL1B、IL1RN、SAA1、CD40、CRLF1、IL6、NFKB1、CD40LG、NOS2A、CRP, IL8、PLA2G7、TNF、FAS、FASLG、IL6ST、LTA、LTB和VWF等 23個; 黏附分子:EVA1、ICAM1、VCAM1、ITGA1、ITGA10、ITGA4、ITGA2、ITGA2B、ITGA3、ITGA5、ITGA6、ITGA7、ITGA8、ITGA9、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAV、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB3、ITGB4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、ITGB8、GLG1、SELE、SELL、SELP、SELPG、MSLN和PECAM1等34個; 血栓相關因子：F3、F7、FGA、FGB、FGG、PLAT、PLAU、PLUAR、

SERPINE1和THBD等10個; 脂代謝相關基因：APOA1、APOA2、APOA4、APOA5、APOB、APOC1、APOC2、APOC3、APOC4、APOD、APOE、APOF、APOH、LPA、PLTP、HSD11B1、OLR1和PPARG等18個; 細胞外基質：MMP1、MMP12、MMP13、MMP2、MMP9、PAPPA、TIMP1、AMH、CCL2、CRLF1、CTF1、EDN1、EDN2、EDN3、PON1、PON2、TNFRSF1A、GRN和MTHFR等19個; 血液循環相關基因：NPPA、NPPB、TNNI3、TNNT2、ACE和DBP等6個; 心機梗塞心力衰竭相關基因：CKM、MB和TNNC1等3個。

1.2.4 熒光定量 PCR 采用 SYBR Green染料(TaKaRa)在ABI StepOnePlus Real-Time PCR系統(ABI)上進行熒光定量PCR。熒光定量PCR采用20μL 反應體系：10 μL SYBR?PremixEx TaqTM(2×),0.4 μL PCR 上游引物(10 μmol/L), 0.4 μL PCR 下游引物(10 μmol/L), 2 μL PCR 模板, 0.4 μL ROX, 6.8μL ddH2O。熒光定量PCR步驟：(1)95 ℃, 30 s; (2)95℃, 5 s; 60 ℃, 34 s, 該步驟重復40個循環; (3)溶解曲線分析, 反應結束后先加熱到 95 ℃, 然后降至60 ℃, 再緩慢升溫至95 ℃, 記錄熒光信號的變化,得出擴增產物的熔解曲線。所有基因PCR產物均純化回收, 并測序驗證, 然后, 將測序結果與華大基因食蟹猴數據庫中相應基因(未發表)比對驗證。所有熒光定量PCR反應均重復3次。

1.2.5 數據分析 采用ABI StepOne Software v2.1對熒光定量PCR結果進行初步分析, 首先, 調整閾值和基線, 將閾值設置在指數期的初期, 同一個基因閾值調成一樣。然后, 去除無表達, 溶解曲線較差, 且 8＞Ct或Ct＞35、△Ct＞13 的反應。采用 2—△△Ct法(Kenneth & Thomas, 2001; Jason et al, 2003)比較低風險組、高風險組和正常實驗猴之間心血管病相關基因表達差異。首先, 優化內標基因和目的基因擴增條件, 分別測定內參基因和目的基因的Ct值,取平均值; 然后, 通過內標基因對目的基因進行校正得到△△Ct; 最后, 通過 2－△△Ct估算目的基因的相對表達量和系統誤差。在計算相對表達量時, 分別以正常對照組樣本為參照, 即將其值轉換成1,低風險組和高風險組樣本再與其比較, 獲得相對表達值。采用EXCEL函數AVERAGE和AEDEV計算所有實驗結果的平均值和標準偏差。用SPSS17.0對實驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 食蟹猴血液生化指標檢測及心血管病風險評價

膳食誘導12個月后, 根據TC、LDL-C、TG、HDL-C、GLU、BMI和年齡等心血管病風險因素, 從30只采用溫和的動脈粥樣硬化膳食喂養的實驗猴中篩選出7只心血管病風險因素危險性較高的實驗猴作為高風險組; 6只心血管病風險因素危險性較低的實驗猴作為低風險組; 5只采用普通飼料喂養的實驗猴作為正常組。各組實驗猴心血管病風險因素平均值及其統計結果如表1所示。BMI和年齡在三組實驗猴之間無顯著差異(P＞0.05); 高風險組實驗猴的血清TC、LDL-C、TG、GLU濃度均顯著高于正常組和低風險組(P＜0.05); 低風險組血清TC、LDL-C顯著高于正常組(P＜0.05), 但其HDL-C也顯著高于正常組, 而且低風險組 HDL-C濃度達到（1.96±0.25）mmol/L, 可抵消掉一個正風險因素。

2.2 食蟹猴心血管病相關基因表達差異

采用ABI StepOne Software v2.1軟件對熒光定量PCR結果進行初步分析, 結果顯示共有65個心血管病相關基因有效表達(表 2), 且這些基因的測序結果與華大基因食蟹猴基因數據庫中相應基因序列基本一致。看家基因GAPDH和RPL13A在三組實驗猴之間表達恒定(P＞0.05), 我們以GAPDH作為看家基因, 正常對照組作為參照, 對心血管病相關基因進行相對定量分析。結果顯示：低風險組實驗猴有 45個心血管病相關基因相對于正常組出現表達差異(P＜0.05); 高風險組實驗猴與正常組相比有39個基因表達上調或者下調(P＜0.05); 低、高風險組實驗猴之間有 14個基因出現表達差異(P＜0.05)。

表1 正常組、低風險組和高風險組實驗猴心血管病風險因素比較結果Tab. 1 Comparison results of cardiovascular risk factors between normal, low-risk and high-risk crab-eating macaques

低、高風險組共有 16個基因相對于正常組表達上調, 19個基因表達下調(P＜0.05), 其中CD40、PLTP、SELPG、IFNG在低風險組中表達量明顯高于高風險組(P＜0.05),GRN、FASLG表達量顯著低于高風險組(P＜0.05)。

此外, 還有 15個心血管病相關基因出現表達差異, 但表達模式特異(P＜0.05)。ACE、TNFRSF1A、IL1RN、ITGAV、PLAT、PLAUR、SERPINE1、NFKB1只在低風險組和正常組之間出現表達差異, 其中ACE、TNFRSF1A在低風險組的表達量顯著高于正常組, 其他基因表達量顯著低于正常組;APOE、ICAM1、TNF在正常組、低風險組和高風險組之間均出現表達差異, 其中APOE和ICAM1在高風險組的表達量最高、正常組次之、低風險組最低,TNF表達模式剛好與之相反;IL10、PPARG、SELL、MTHFR在低風險組和高風險組之間出現表達差異,其中IL10、PPARG、SELL在低風險組的表達量顯著高于高風險組, 而MTHFR在低風險組的表達量顯著低于高風險組, 而IL10在高風險組表達量顯著低于正常組,PPAR在低風險組表達量顯著高于正常組,SELL在低風險組表達量顯著低于正常組。

表2 正常組、低風險組和高風險組實驗猴心血管病相關基因相對表達量Tab. 2 Relative expression quantity of cardiovascular disease-related genes between normal,low-risk and high-risk crab-eating macaques

續表

2.3 人和食蟹猴心血管病相關基因表達模式比較

熒光定量PCR共檢測到42個心血管病相關基因在人和食蟹猴外周血白細胞內均有效表達。分別以正常人和食蟹猴作為參照, 計算心血管病相關基因在心血管疾病高風險人和食蟹猴中相對表達量。通過比較分析人和食蟹猴心血管病相關基因表達模式, 我們發現共有22個心血管病相關基因在人和食蟹猴中隨著心血管病危險性升高表達模式一致。其中APOA1、APOF、FGG、GLG1、IL6ST、LTA和PLTP在心血管疾病高風險人和心血管疾病高風險食蟹猴中表達量均顯著上調(P＜0.05)(圖 1);CCL2、CD40LG、DBP等 13個基因均表達下調(P＜0.05)(圖2); 此外，SERPINE1和TNFRSF1B在人和食蟹猴中均表達恒定(P＞0.05)。

圖1 人和食蟹猴中表達均上調的心血管病相關基因Fig. 1 Up-regulated cardiovascular disease-related genes between human and crab-eating macaques

圖2 人和食蟹猴中表達均下調的心血管病相關基因Fig. 2 Down-regulated cardiovascular disease-related genes between human and crab-eating macaques

3 討 論

20世紀 70年代末誕生了基因診斷, 基因診斷可以揭示尚未出現癥狀時與疾病相關的基因狀態,從而可以對表型正常的攜帶者及某種疾病的易感者作出診斷和預測。心血管病在出現明顯臨床癥狀之前有一個較長的潛伏期, 通常在出現癥狀時已進入后期, 急性冠心病事件, 心肌梗塞等通常為突然發生, 常常來不及醫治(World Health Organization,2007; World Health Organization, 2003)。因此, 利用基因診斷技術對心血管病進行風險預警和早期診斷對人類健康意義重大。

我們采用實時熒光定量PCR方法檢測低風險、高風險和正常組食蟹猴外周血白細胞內心血管病相關基因表達狀態, 結果共檢測到 65個心血管病相關基因。通過分析三組實驗猴心血管病危險性和基因表達的相關性, 我們發現如果用傳統的心血管病風險因素對實驗猴進行心血管病危險性評估, 高風險組實驗猴心血管病危險性要顯著高于低風險組和正常組實驗猴, 而低風險組和正常組之間差異不大；但是實時熒光定量PCR結果顯示高、低風險組之間只有14個心血管病相關基因出現表達差異,低風險和正常組之間卻有 45個心血管病相關基因出現表達差異。該結果表明，心血管病早期心血管病相關基因表達變化的出現往往要早于傳統的風險因素, 而那些在正常組和低風險組之間出現表達差異的基因可作為心血管病風險預警指標。

大量研究表明, 血脂異常、炎癥、血栓、內皮損傷等都是心血管病的重要危險因素(Toru,2009)。炎癥因子(David et al, 2004)C-反應蛋白、ICAM1、IL6、CD40LG、IL18, 以及載脂蛋白(Chen et al,2007)APOA1、APOB等已經應用于心血管病早期診斷和研究當中。因此, 我們篩選出來的出現表達差異的基因不但能反映相應的病理狀態, 還能應用于心血管病風險預警和早期診斷當中。16個表達明顯上調和 19個表達明顯下調的心血管病相關基因可用于區分正常和異常;CD40、PLTP、SELPG、IFNG、GRN、FASLG和15個表達模式特異的心血管病相關基因可用于區分低風險和高風險。

共有 42個心血管病相關基因在人和食蟹猴外周血白細胞內均有效表達, 其中 22個心血管病相關基因在人和食蟹猴之間表達模式一致, 這表明食蟹猴的研究結果也可應用于人。有些基因在人和食蟹猴之間表達模式不一致, 這可能是由人猴差異或其他病理現象導致的, 我們正在研究其具體原因。

目前 PCR芯片技術已經被應用于心血管病臨床診斷當中, 但是其在心血管病風險預警和早期診斷中的應用還有待開發。通過進一步研究確認上述心血管病相關基因的表達模式, 然后將這些基因制備成 PCR芯片, 再結合傳統的心血管病風險因素可更早、更準確的對心血管病進行風險預警和早期診斷。

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Correlation between cardiovascular risk factors and the expression
of cardiovascular disease related genes in cynomolgus monkeys

XIA Ji-Liang1, HAO Xiang-Fen1, ZENG Xiao-Ming2, JIN Li-Sha1, ZHOU Tong2, LI Xue-Jia1,SUN Yun-Xiao1, RAO Jun-Hua1, LIU Xiao-Ming1, PENG Bai-Lu1,*

(1.Guangdong Entomological Institute,Guangzhou510260,China;
2.Guangdong Landao Biological Technology Limited Company,Guangzhou510555,China)

The correlation between cardiovascular risk factors and cardiovascular disease related genes plays an important role in early-warning risk and early diagnosis. Thirty middle-aged male crab-eating macaques were fed a moderately atherogenic diet (0.053 mg cholesterol/kJ and 40% of calories as saturated fat) for twelve months. According to cardiovascular risk factors, we selected low-risk and high-risk crab-eating macaques, then analyzed the expression of 113 cardiovascular related genes by real-time PCR. A total of 65 genes were detected in peripheral blood leukocytes by real-time PCR. Sixteen up-regulated genes and nineteen down-regulated genes were detected in low-risk and high-risk crab-eating macaques compared to normal crab-eating macaques (P＜0.05), in addition to fifteen genes that showed unique expression patterns (P＜0.05). We also detected 42 genes in human peripheral blood leukocytes. The expression patterns of 22 genes were consistent between human and crab-eating macaques. These results narrowed the scope of genes for further research.

Cardiovascular diseases; Early-warning risk; Early diagnosis; Crab-eating macaque; Real-time PCR;Peripheral blood leukocytes

Q959.848; R54

A

0254-5853-(2011)03-0293-07

10.3724/SP.J.1141.2011.03293

2010-12-24；接受日期：2011-03-10

國家科技重大專項人類重大疾病靈長類動物模型資源平臺的建設項目(2011ZX09307-303-03); 廣州市科技計劃項目大型實驗動物國際認證與外包服務項目(2009A1-E051)

?通訊作者(Corresponding author)，E-mail: pengbailu@hotmail.com

夏機良(1983－), 男, 碩士, 專業方向：靈長類疾病模型制備和疾病早期診斷。E-mail:jiliangxia2009@163.com