中老年食蟹猴群體自發(fā)型糖尿病的篩選

萬(wàn)玉玲, 張艷春, 彭白露 李學(xué)家 季 芳 靳麗莎 饒軍華 劉曉明

(1. 廣東藍(lán)島生物技術(shù)有限公司, 廣東 廣州 510555; 2. 廣東省昆蟲(chóng)研究所, 廣東 廣州 510260)

中老年食蟹猴群體自發(fā)型糖尿病的篩選

萬(wàn)玉玲1,#, 張艷春2,#, 彭白露1, 李學(xué)家2, 季 芳2, 靳麗莎2, 饒軍華1, 劉曉明1,2,*

(1. 廣東藍(lán)島生物技術(shù)有限公司, 廣東 廣州 510555; 2. 廣東省昆蟲(chóng)研究所, 廣東 廣州 510260)

篩選440只中老年偏胖食蟹猴群體中自發(fā)糖尿病個(gè)體, 并探討食蟹猴群體中糖尿病粗篩的方法。以調(diào)查基礎(chǔ)血糖值為基礎(chǔ), 推斷疑似糖尿病血糖值, 后經(jīng)OGTT(口服糖耐量)和尿檢結(jié)果驗(yàn)證該血糖值是否準(zhǔn)確。結(jié)果顯示中老年偏胖食蟹猴群體血糖值為(3.88±0.98) mmol/L, 其中56只食蟹猴血糖值大于5.0 mmol/L, 被初步定為糖尿病個(gè)體。這些個(gè)體全部糖耐量異常, 且36只(69.23%)出現(xiàn)尿糖陽(yáng)性, 證明血糖值大于5.0 mmol/L可作為本群體食蟹猴糖尿病的粗篩標(biāo)準(zhǔn)。由于針對(duì)中老年偏胖食蟹猴群體, 患病率為12.72% (56/440), 高于我國(guó)糖尿病患病率(9.7%)。雖然該實(shí)驗(yàn)的糖尿病血糖指標(biāo)并不適用于所有食蟹猴群體, 但是該篩選的流程簡(jiǎn)單快捷, 對(duì)動(dòng)物損傷小,可適用于大群體糖尿病的篩選。

自發(fā)性糖尿??；篩選；血糖；食蟹猴

隨著生活水平提高, 糖尿病成為全球性的重大疾病, 世界衛(wèi)生組織預(yù)計(jì), 到2025年, 全球糖尿病患者人數(shù)將增至3億, 《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》2010年研究數(shù)據(jù)表明, 我國(guó)總體患病率已達(dá)9.7%, 糖尿病前期的患病率高達(dá)15.5%(Yang et al, 2010)。因此,糖尿病藥物的研究開(kāi)發(fā)已成為目前生物醫(yī)藥研究重點(diǎn), 而適宜的糖尿病動(dòng)物模型是深入研究糖尿病及其并發(fā)癥的基礎(chǔ)。

食蟹猴體型小巧，性情溫和, 與人類(lèi)的遺傳物質(zhì)具有高度的同源性, 在組織結(jié)構(gòu)、 生理和代謝功能等方面顯示了許多與人類(lèi)相似的特征, 成為目前應(yīng)用最為廣泛的非人靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(Wang et al,2007)。同時(shí), 食蟹猴自發(fā)性糖尿病的發(fā)生情況也類(lèi)似于人類(lèi), 發(fā)病前經(jīng)歷胰島素抵抗、糖代謝異常、高胰島素血癥等階段, 并在其后代中也發(fā)現(xiàn)糖耐量異常等癥狀(Ramsey et al, 2000; Hotta et al, 2001;Wagner et al, 2001; Wagner et al, 2006)。此外, 食蟹猴與嚙齒類(lèi)動(dòng)物比，其生命周期長(zhǎng), 能夠充分地觀察和研究糖尿病動(dòng)物的糖代謝、脂代謝、蛋白質(zhì)代謝的異常和胰腺、肝臟、腎臟等組織的病理學(xué)改變以及由糖尿病引發(fā)的其他各種并發(fā)癥(Cefalu et al,2004; Slynkova et al, 2006), 因而, 它在研究糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及防治等方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性, 是進(jìn)行糖尿病生物醫(yī)藥研究理想的模型。

本研究采用便攜式血糖儀對(duì)440只食蟹猴進(jìn)行血糖值的調(diào)查基礎(chǔ)上, 結(jié)合OGTT及尿糖檢測(cè)結(jié)果確定糖尿病粗篩的指標(biāo), 對(duì)食蟹猴群糖尿病進(jìn)行篩選, 篩選出的個(gè)體可應(yīng)用于糖尿病的相關(guān)研究, 并通過(guò)本次研究, 建立一套食蟹猴群體糖尿病的快速篩選方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～24歲偏胖中老年食蟹猴共有440只, 其中雄性271只和雌性169只, 由廣東省昆蟲(chóng)研究所華南靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物研究開(kāi)發(fā)中心提供。

1.1.2 試劑與儀器 氯胺酮, 購(gòu)自沈陽(yáng)市獸藥廠;便攜式血糖檢測(cè)儀, 美國(guó)強(qiáng)生, 穩(wěn)豪型血糖試紙;全自動(dòng)生化檢測(cè)儀, 日立 7020; 拜耳尿液分析儀Clinitek Status, 德國(guó)BAYER, 滴寶干化學(xué)試尿液試紙條。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物預(yù)處理 將食蟹猴放置單籠靜止一周, 飲食、飲水照常供應(yīng), 記錄其日常飲食情況。于采血, 采尿檢測(cè)前一天開(kāi)始禁食, 禁食時(shí)間保證在14～16 h之間。

1.2.2 血糖檢測(cè)及血清, 尿液采集 于凌晨6點(diǎn)左右, 采集食蟹猴尿液; 氯胺酮 5～10 mg/kg劑量對(duì)食蟹猴進(jìn)行肌肉注射麻醉約10 min, 待實(shí)驗(yàn)猴到完全喪失意識(shí), 立即針刺后肢靜脈取血, 并用快速血糖儀檢測(cè)其血糖值。其中部分個(gè)體還需要后股靜脈取血 3 ml, 樣本室溫靜置 30 min后 4 ℃, 4 000 g/min離心10 min, 取上層血清用于生化檢測(cè), 指標(biāo)有丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alt)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Ast)、甘油三脂(TG)、膽固醇(CHO)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.2.3 OGTT實(shí)驗(yàn) 按4 g/kg體重的劑量(50%葡萄糖溶液)在2 min內(nèi)鼻飼灌胃后, 分別在0、30、60和120 min共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)針刺后肢靜脈取血, 用快速血糖儀測(cè)定血糖。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法 采用 Excel和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 數(shù)據(jù)以x±S表示, 各組間差異比較采用單因素方差分析, 以P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 中老年食蟹猴群體血糖值調(diào)查

中老年偏胖食蟹猴群基礎(chǔ)血糖值為(3.88±0.98)mmol/L, 其中雄性食蟹猴的血糖值為(3.72±0.86)mmol/L, 雌性食蟹猴的血糖值為(4.14±1.11)mmol/L, 雌性血糖值是顯著高于雄性(表1)。

表1 中老年食蟹猴基礎(chǔ)血糖值(x±s)Tab. 1 Basal blood glucose of middle- and old-aged cynomolgus monkeys

根據(jù)中老年食蟹猴血糖值分布表 2顯示, 87%以上個(gè)體的血糖值分布低于5.0 mmol/L; 在血糖值大于5.0 mmol/L個(gè)體中, 雄性20只, 占雄性群體的7.38 %, 雌性36只, 占雌性群體的21.30 %; 大于10 mmol/L個(gè)體中, 雄性2只, 占雄性群體的0.74 %,雌性為4只, 占雌性群體的2.37 %, 雌性高血糖出現(xiàn)的比例明顯高于雄性。通過(guò)血糖值的調(diào)查, 初步假定血糖值大于5.0 mmol/L為糖尿病疑似個(gè)體, 共有56只食蟹猴為疑似糖尿病個(gè)體。

2.2 OGTT和尿糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)血糖值不同的 31只食蟹猴(血糖水平分布見(jiàn)表3)進(jìn)行OGTT。圖1顯示不同血糖值的OGTT差異, 只有初始血糖值大于 5.0 mmol/L組, OGTT的2 h后血糖值仍然沒(méi)有下降的趨勢(shì), 其余三組都存在不同程度的下降, 且初始血糖值最低組別(＜4.0 mmol/L), 下降最為明顯。結(jié)合尿檢結(jié)果（如表3）所示, 當(dāng)初始血糖值小于4.0 mmol/L時(shí), 不存在糖耐量異常, 且尿糖為陰性。當(dāng)初始值位于 4.0～4.5 mmol/L之間時(shí), 3/7個(gè)體糖耐量正常, 所有個(gè)體尿糖為陰性。當(dāng)初始值位于4.5～5.0 mmol/L之間時(shí),4/6個(gè)體糖尿量異常, 所有個(gè)體尿糖值仍為陰性。當(dāng)初始值大于5.0 mmol/L以后, 所有的個(gè)體糖耐量都異常, 69.2%個(gè)體出現(xiàn)尿糖陽(yáng)性。綜合OGTT, 尿檢和血糖值的調(diào)查結(jié)果, 可以定義血糖值大于 5.0 mmol/L為糖尿病個(gè)體, 確定疑似的56只食蟹猴為糖尿病個(gè)體。

表2 中老年食蟹猴血糖值調(diào)查表Tab. 2 Survey of blood glucose in middle- and old-aged cynomolgus monkeys

表3 不同血糖值對(duì)應(yīng)的OGTT異常及尿糖陽(yáng)性情況Tab. 3 Impaired glucose tolerance and positive urineglucose in different levels of blood glucose

圖1 不同血糖值的水平OGTTFig. 1 The OGTT corresponding to the different levels of blood glucose

2.3 生理生化值

根據(jù)上述結(jié)果, 把中老年食蟹猴群體分為糖尿病組和正常組, 對(duì)兩者常規(guī)生理生化值進(jìn)行比較。從表4中可以看出, 只有TG和GLU存在差異, 其余各指標(biāo)差異并不顯著。

表4 食蟹猴糖尿病組和正常組的基礎(chǔ)生理生化值的比較Tab. 4 Comparative analysis of basal blood physiology and biochemical values in the diabetes and normal cynomolgus monkeys

3 分 析

Wang et al (2007)測(cè)得食蟹猴空腹血糖值為(5.56±1.92) mmol/L, 雄性為(5.21±1.96) mmol/L,雌性為(5.94±1.85) mmol/L, 雌性血糖值高于雄性。Zhang et al (2005)測(cè)得食蟹猴血糖值為(3.67±1.5)mmol/L。Xu et al (2009)測(cè)得食蟹猴空腹血糖為(5.10士 1.89) mmol/L。本實(shí)驗(yàn)排除極大值的影響外, 檢測(cè)得到中老年偏胖食蟹猴群體基礎(chǔ)血糖值范圍是(3.88±0.98) mmol/L, 雌性食蟹猴血糖值高于雄性。食蟹猴的基礎(chǔ)血糖值調(diào)查由于會(huì)受到種群的年齡(Wang et al, 2004)、檢測(cè)方法(Wen and Sun, 2003)、飼養(yǎng)方式，甚至取樣的時(shí)間(Zeng et al, 2010)等多種因素的影響, 因而還缺少統(tǒng)一的結(jié)論。因此, 不同食蟹猴群體進(jìn)行糖尿病篩查的過(guò)程中, 應(yīng)該以本群體的基礎(chǔ)血糖值作為背景參考, 推斷出適用于本群體糖尿病篩選的血糖值。本實(shí)驗(yàn)的食蟹猴的基礎(chǔ)血糖值也只適合采用便攜式血糖儀檢測(cè), 同時(shí)，針對(duì)中老年偏胖食蟹猴群體或具有類(lèi)似特征群體。

2010年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)制定的人類(lèi)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)：HBA1C(糖化血紅蛋白)≥6.5%或空腹血糖≥7.0 mmol/L(126 mg/dL)或OGTT試驗(yàn)2 h血糖≥11.1 mmol/L(200 mg/dL)或有高血糖的癥狀或高血糖危象, 且隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L(200 mg/dl)。對(duì)于非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn), 尚缺少統(tǒng)一的結(jié)論。Leroith et al (2004)定義獼猴糖尿病血糖值為≥5.6 mmol/L, Xu et al (2009)參照猴的正?？崭寡侵?5.10±1.89) mmol/L, 定義≥8.0 mmol/L 為糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn), Wanger et al (2006)根據(jù)食蟹猴的基礎(chǔ)血糖值低于人基礎(chǔ)血糖值 1～1.7 mmol/L, 推斷當(dāng)食蟹猴的血糖值在5.5～7 mmol/L則極其可能為糖尿病, 同時(shí)也提出, 往往在血糖值還未達(dá)到這個(gè)值的時(shí)候, 就已出現(xiàn)了臨床癥狀。本研究在人工飼養(yǎng)條件下篩查中老年偏胖食蟹猴的糖尿病個(gè)體, 根據(jù)群體基礎(chǔ)血糖值推斷當(dāng)血糖值大于 5.0 mmol/L為疑似糖尿病個(gè)體, 后經(jīng)OGTT和尿糖結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證該推斷可作為本群體食蟹猴糖尿病篩選標(biāo)準(zhǔn)。該血糖值診斷標(biāo)準(zhǔn)較其他研究偏低, 原因除群體基礎(chǔ)血糖偏低影響外, 還由于本實(shí)驗(yàn)室采用便攜式血糖儀測(cè)得的食蟹猴血糖值較全自動(dòng)生化分析儀測(cè)得結(jié)果低 0.5 mmol/L左右(本實(shí)驗(yàn)室待發(fā)表的資料)。最終在群體中粗篩出糖尿病食蟹猴 56只, 比例為12.72%, 高于我國(guó)糖尿病患病率9.7%(Yang et al,2010), 也高于食蟹猴的糖尿病患率 3%(Wang et al, 2004), 主要是由于本研究針對(duì)中老年偏胖的群體, 該群體本身就是糖尿病的高危群體(Tigno et al,2004; Kavanagh et al, 2007)。

通過(guò)本研究, 粗篩的糖尿病食蟹猴可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究, 食蟹猴糖尿病的血糖值診斷標(biāo)準(zhǔn)可適用于具有相似特征的群體。除此之外, 本研究針對(duì)中老年的偏胖群體, 利用群體基礎(chǔ)血糖值推斷疑似的糖尿病血糖值, 后經(jīng) OGTT和尿糖結(jié)果驗(yàn)證, 確定該群體糖尿病血糖值診斷標(biāo)準(zhǔn), 粗篩糖尿病個(gè)體。該流程簡(jiǎn)單快捷, 對(duì)動(dòng)物損傷小, 可以應(yīng)用到大規(guī)模群體篩查中。

致謝：本實(shí)驗(yàn)在一線作業(yè)過(guò)程中, 得到了藍(lán)島公司生產(chǎn)一線同志們的大力幫助, 在此特別致謝！

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Screening of spontaneous diabetes mellitus in middle- and old-aged cynomolgus monkey

WAN Yu-Ling1,#, ZHANG Yan-Chun2,#, PENG Bai-Lu1, LI Xue-Jia2, JI Fang2,JIN Li-Sha2, RAO Jun-Hua1, LIU Xiao-Ming1,2,*

(1.Guangdong Landau Biotechnology Co. Ltd,Guangzhou510555,China; 2.Guangdong Entomological Institute,Guangzhou510260,China)

To screen spontaneous diabetic mellitus and explore methods for its rapid identification, the basal and inferred levels of blood glucose of 440 overweight, middle- and old-aged cynomolgus monkeys were analyzed.Diagnostic diabetes was further validated by the oral glucose tolerance test (OGTT) and urine glucose. The average level of blood glucose of these cynomolgus monkeys was (3.88±0.98) mmol/L, which was lower than the level for suspected diabetes (5.0 mmol/L). Of them, 56 (12.72%) monkeys were identified with levels of blood glucose greater than 5.0 mmol/L and diagnosed as the diabetic subjects. This population showed impaired glucose tolerance using the OGTT and 39 of the 56 (69.23%) had glucose positive urine. The methods for screening diabetic mellitus used in this study were simple, quick, and limited the harm to animals. However, the incidence of diabetes was higher in these tested monkeys than in the regular human population in China (9.7%), suggesting that these methods are useful for screening diabetic disease in a large population but not suitable for all cynomolgus monkeys.

Spontaneous diabetes mellitus; Screening; Blood glucose; Cynomolgus monkey

Q959.848； R587.2；R-332

A

0254-5853-(2011)03-0307-04

10.3724/SP.J.1141.2011.03307

2010-12-23；接受日期：2011-03-02

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目 (2009A1-E051, 2010U1-E00811); 廣東省林業(yè)局項(xiàng)目 (2009KJCX016); 國(guó)家”十二五”項(xiàng)目(2011ZX09307-03-303)

?通訊作者(Corresponding author)，E-mail: xemoonliu@hotmail.com

#并列第一作者(Authors contribute equally to the work)

萬(wàn)玉玲(1979—), 女, 碩士, 研究方向：靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué); 張艷春(1984—), 女, 碩士, 研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分子生物學(xué)