南疆地區(qū)青貯玉米中乳酸菌的分離與鑒定

吳書(shū)奇 史卉玲 席琳 喬楊 麗娟 張玲 馬春暉

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

乳酸菌是一類可利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱［1］。乳酸菌種類很多，目前在細(xì)菌分類學(xué)上被分為乳桿菌屬(Lactobaci llus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)，芽孢桿菌屬(Bacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串球菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、利斯特氏菌屬(Listeria)等30幾個(gè)屬［2］。按發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)物不同，可分為同型乳酸發(fā)酵菌(同型乳酸菌)和異型乳酸發(fā)酵菌(混合乳酸菌)兩大類［3］。乳酸菌用途廣泛，它令食物美味，并延長(zhǎng)保存期，還可以作為保健用品和藥品，同時(shí)乳酸菌在飼料工業(yè)中也起著重要的作用。目前合理利用牧草和作物秸稈是當(dāng)今家畜飼料學(xué)研究的主要課題之一，尤其是在青貯飼料制備這一領(lǐng)域，已經(jīng)有很多國(guó)家如歐盟國(guó)家和美國(guó)的研究者對(duì)乳酸菌在青貯飼料制備中的應(yīng)用進(jìn)行了大量深入的研究，乳酸菌在家畜飼養(yǎng)和飼料中有著重要的作用，特別是應(yīng)用于青貯飼料的調(diào)制［2，4］。由于南疆地區(qū)氣候干燥，降雨量少，不適宜植被生長(zhǎng)，牧草缺口比較大，但綠洲區(qū)秸稈資源豐富，通過(guò)秸稈青貯，充分利用好這些秸稈資源，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益，將有助于節(jié)約糧食資源。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菑那噘A玉米中分離乳酸菌，篩選出pH下降快，產(chǎn)乳酸多的乳酸菌菌株，并且通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)方法進(jìn)行了初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

取阿拉爾十團(tuán)牛場(chǎng)青貯窖玉米秸稈青貯，放入自封袋中扎好。記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等。

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒(Bioteke corporation);X －gal、IPTG、瓊脂糖;氨芐青霉素、溶菌酶、蛋白酶K(Takara公司);DL2000(西安沃爾森公司);引物由華大基因合成;TIANamp Bacteria DNA Kit(天根生化科技有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、葡萄糖20.0 g、1.0mL 吐溫 80、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀 2.0 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、蒸餾水1 000mL，121℃滅菌20 min，pH 6.2 －6.4，固體培養(yǎng)基加入瓊脂15.0 g/L。

LB培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0g、氯化鈉10.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH為7。固體培養(yǎng)基加入瓊脂15.0 g/L。

1.1.4 儀器與設(shè)備

上海博迅實(shí)業(yè)有限公司HPX－9162MPE電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海申安醫(yī)療儀器廠LDZX－50KB立式壓力蒸汽滅菌器，HANNA PH211臺(tái)式酸度計(jì)，Heal Force高速冷凍離心機(jī)，金壇THZ－8B汽浴恒溫?fù)u床，中科美菱DW－HW318超低溫冰箱，博迅SW－CJ－1FD潔凈工作臺(tái)，TECHNE TC－512 PCR儀，DYY－10C型電泳儀，Tanon凝膠成像儀。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選

菌株的篩選與純化取10 g樣品放入液體MRS培養(yǎng)基，室溫發(fā)酵24 h后，從上清液中吸取1mL液體，加入 9 mL 的無(wú)菌水中，梯度稀釋 10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，取 10－3，10－4，10－5，涂布于固體MRS平板分離培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)72 h，觀察描述菌落特征，挑取單菌落，在固體MRS培養(yǎng)基繼續(xù)劃線純化，至少純化兩次，直至出現(xiàn)單菌落，且菌落特征和菌體特征均一為止［5－6］。挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后，儲(chǔ)存于30%甘油管中，－80℃低溫冰箱凍存。

1.2.2 產(chǎn)酸速率的測(cè)定 將劃線分離菌株接種于裝盛有30 mL MRS液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)72 h，測(cè)量發(fā)酵液的pH值。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 生理生化鑒定

篩選的乳酸菌菌株在MRS培養(yǎng)基上活化24 h后，根據(jù)東秀珠，凌代文等介紹的方法，將分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶試驗(yàn)，然后按照乳酸菌的屬鑒定程序區(qū)分乳酸菌不同的菌屬［7］。

通過(guò)菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)及生理生化反應(yīng)結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》中相關(guān)分類標(biāo)準(zhǔn)比較，可初步鑒定篩選菌株屬種［8］。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

1.3.2.1 乳酸菌分離株菌株基因組的提取，按照試劑盒操作步驟進(jìn)行基因組提取。

1.3.2.2 引物的序列為 27f:5＇－ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3＇1492r:5＇－GGTTACCTTGTT ACGACTT －3＇

1.3.2.3 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)與序列測(cè)定

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL:10×PCR buffer 2.0 μL;dNTP(2.5 mM)1 μL;Primers(20 μM):Forward 1.0 μL;Reverse 1.0 μL;Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.5 μL;DNAtemplate(50 ng/μL)0.5 μL;加水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件如下:預(yù)變性，95 ℃，3 min;變性，94 ℃，1 min;退火，53 ℃，1 min;引物延伸，72℃，1 min20 s，30個(gè)循環(huán);延伸，72℃，8 min。16S rRNA的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物上樣量為5 μL，電泳緩沖液使用0.5 ×TAE，100 V 電泳30 min，EB(0.5 μg/mL)染色后在紫外燈下觀察結(jié)果，PCR產(chǎn)物為約1.5 kb大小的電泳條帶，凝膠成像儀下觀察拍照。

測(cè)序工作由天根生化科技(北京)有限公司完成。用NCBI的Blast程序?qū)⒌玫?6S rDNA序列與GenBank中已知的16S rRNA序列進(jìn)行比較鑒定，找出與目的基因序列同源性高的已知分類的菌種，提取其16S rRNA序列，使用軟件SeqPup，錄入菌株的16S rRNA序列和從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中提取的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA序列，進(jìn)行多序列匹配排列，用軟件 Mega 4.1 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［9］。

圖1 不同菌株的pH值變化情況

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離與保存

采用傳統(tǒng)的分離純化方法從青貯樣品中共分離出4株菌，菌株分別標(biāo)記為菌株D、菌株F、菌株J、菌株L，純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 乳酸菌產(chǎn)酸速率的測(cè)定

通常在實(shí)際生產(chǎn)中，青貯飼料發(fā)酵初期，迅速降低的pH值可以抑制原料中酵母菌、霉菌以及腐敗菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)酸速率是衡量乳酸菌活力的重要指標(biāo)。將實(shí)驗(yàn)篩選的4個(gè)菌株做一個(gè)發(fā)酵試驗(yàn)，按照3%的接種量轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀測(cè)pH值，初步篩選產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株。由圖1可以看出，發(fā)酵48 h后菌株F與菌株J產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。淘汰菌株D和菌株L，選擇pH值下降快、產(chǎn)酸量多的菌株F與菌株J保留，進(jìn)行進(jìn)一步的菌株鑒定。

將純化好的菌珠F與菌株J接種分別加入高壓滅菌的MRS液體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔8 h測(cè)定其pH值變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌珠F與菌株J在發(fā)酵24 h后pH值穩(wěn)定在4.0以下，適宜于做青貯乳酸菌。

圖2 菌株F和菌侏J的產(chǎn)酸速率的測(cè)定

2.3 菌株鑒定

2.3.1 生理生化鑒定

菌株F，菌落不透明，白色微黃;經(jīng)革蘭氏染色后在油鏡下觀察，細(xì)胞球形，成鏈狀;菌株F接觸酶反應(yīng)為陽(yáng)性。菌株J白色，圓形，菌落中央隆起，表面光滑、濕潤(rùn)，邊緣整齊;經(jīng)革蘭氏染色后在油鏡下觀察，菌株J細(xì)胞為直桿狀，成對(duì)分布，菌株J接觸酶反應(yīng)為陽(yáng)性。菌株F和菌株J均可在鹽性條件(6.5%的NaCl)下生長(zhǎng)。

2.3.2 乳酸菌菌株16S rRNA序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)建立

菌株F與菌株J提取基因組后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1500bp左右有一條清晰條帶，和預(yù)期結(jié)果一致。

圖3 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖4 菌株F與系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)

經(jīng)過(guò)Blast序列比對(duì)，分別挑選與菌株F和菌株J序列同源性在98%以上的標(biāo)準(zhǔn)菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。菌株F和菌株J在系統(tǒng)發(fā)育上屬于厚壁菌門Firmicutes，芽孢桿菌綱 Bacilli，芽孢桿菌目 Bacillales;菌株F為Staphylococcus;菌株J屬于芽孢桿菌科Bacillacea，芽孢桿菌屬Bacillus。因此推測(cè)菌株F為葡萄球菌屬，菌株J為芽孢桿菌屬。

3 討論

16S rRNA具有功能與進(jìn)化上的同源性，其序列進(jìn)化變異頻率緩慢，在結(jié)構(gòu)上極具保守性，并且其分子大小適中，攜帶有充分的生物信息，因此16S rRNA的序列檢測(cè)已被成功地建立為一種鑒定微生物種、屬、家族的標(biāo)準(zhǔn)方法［10］。

本試驗(yàn)從青貯玉米中篩選出兩株菌，菌株F和菌株J，經(jīng)過(guò)形態(tài)特征、生理生化鑒定和16S rRNA序列分析方法鑒定，初步確定F為葡萄球菌屬，J為芽孢桿菌屬，且兩株菌在發(fā)酵試驗(yàn)中24 h后pH值下降到4以下，產(chǎn)酸能力均很強(qiáng)，乳酸菌的初步分離和鑒定是本項(xiàng)研究的第一步工作，但作為添加劑的應(yīng)用還需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)篩選出產(chǎn)酸能力強(qiáng)的兩株菌，初步確定菌株F為屬于葡萄球菌屬，菌株J屬于芽孢桿菌屬，且兩株菌在24 h內(nèi) pH值下降到4以下，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，可以作為秸稈青貯添加菌株，對(duì)促進(jìn)南疆秸稈資源的青貯利用，緩解飼草不足具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

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