急性胰腺炎實驗性動物模型研究現狀

李昌陽，禇朝順(綜述)，汪寶林(審校)

(南京醫科大學第二附屬醫院普外科，南京210011)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是普外科最常見的急腹癥之一，發病急、進展快、并發癥多，病死率高［1］。AP的發病機制仍未完全闡明，且治療也未能總結出卓有成效的方案。因此，建立一個可靠的胰腺炎模型對AP發病機制、病理生理以及治療效果的研究是至關重要的。現將近年來AP模型的研究進展與發展前景作如下綜述。

1 AP模型動物的選擇

1.1 常規動物 目前用于制備胰腺炎模型的動物主要有犬、大鼠、小鼠，有的也用貓、兔、猴等，其中犬和大鼠是制作胰腺炎模型較常用的動物。犬的消化系統發達，與人有相同的消化過程，且易飼養，不易生病、死亡，特別適合消化系統的實驗研究;而大鼠繁殖快而多，價格便宜，易飼養，胰腺薄而分葉，誘發胰腺炎后耐受力差，易死亡。但鑒于經濟和操作困難，目前實驗研究中仍多采用大鼠或小鼠。

1.2 基因工程動物 基因工程動物運用轉基因、基因打靶及基因剔除等技術，較多應用于發病機制和治療方面的研究，比如通過在大鼠體內過度表達內皮素來證實內皮素參與胰腺炎的發病機制;用基因剔除小鼠來證明血小板在AP中的作用［2，3］?？梢姂没蚬こ虅游锟墒箤嶒灧椒ǜ唵?，具有穩定性高、重復性好等優點，但其費用昂貴，操作要求高，國內目前應用不多。

2 AP模型常用方法

2.1 侵入性方法

2.1.1 胰膽管注射法 目前胰膽管注射法運用最為廣泛，根據反流學原理向胰膽管中注入不同外源性的物質，直接損傷胰腺組織或通過激活內源性胰酶損傷胰腺來建立AP模型。此法的優點:臨床意義較強，造模成功率高，可重復性，程度易控制。但是其操作精細，易形成膽漏，病死率較高。1980 年，Aho 等［4］首次采用切開大鼠十二指腸前壁，再經十二指腸乳頭插入塑料管，向胰膽管內逆行注射?；悄懰徕c(sodium taurocholate，ST)成功復制了AP模型，24 h內胰腺細胞即可出現水腫、出血、壞死等。但是此方法易損傷十二指腸血管引起出血，ST易經胰膽管開口和穿刺口溢出影響造模成功。如今在此基礎上進行了大量改進，多采用經十二指腸直接穿刺法，找到十二指腸乳頭并確定膽胰管開口，在其對側腸系膜無血管區鉆一小孔將導管逆行插入膽胰管，也可采用直接胰膽管逆行穿刺法，直接經膽胰管穿刺逆行注射誘導劑復制AP。對這兩種方法進行比較后發現，經十二指腸直接穿刺法明顯優于直接胰膽管逆行穿刺法，但胰膽管直接穿刺法操作方便，在某些短期研究中仍可選用［5］。

胰膽管注射法所致胰腺炎的嚴重程度和注入藥物、注入藥物時的濃度、計量、速度等密切相關。目前較常注入的藥物有ST、脫氧膽酸，此外還有乙醇、生理鹽水、細菌及毒素(如大腸埃希菌、葡萄球菌的菌體或毒素)、胰酶或者胰酶激活劑等［6-8］。不同的濃度造成的損傷也不同，現多集中在通過控制注射物質的濃度來控制病變程度及動物的病死率［9］。有學者對不同濃度的ST誘導AP模型進行了系列研究，分別采用濃度為 0.25%、1.0%、2.0%、3.5% 的ST溶液1 mL/kg逆行注入大鼠胰管，結果1.0%和2.0%ST分別誘導輕度及重度水腫型胰腺炎;3.5%的ST則誘導壞死型胰腺炎，可見胰腺病變程度與ST誘導濃度呈正相關。Wittel等［10］也證實了胰腺病變程度與ST誘導濃度呈正相關，濃度為5%的ST溶所致的病變程度稍重于4%的ST，但是病死率遠遠超過4%ST。邱嘉華等［11］指出濃度為4.5%的ST誘導急性壞死性胰腺炎大鼠模型具有較高的多器官功能障礙綜合征發生率和24 h生存率，是急性壞死性胰腺炎并發多器官功能障礙綜合征診治研究的理想建模濃度?，F在常用的濃度為3%～5%［12，13］，注入速度不同，病變的程度也不同，所以微量泵被廣泛應用于控制注入的速度［14］。

此外，聯合應用硬膜外導管和創面封閉膠封閉穿刺孔，創傷小，不易出血和形成瘺，操作簡單，誘導成功率高，模型穩定。熟練、精細的顯微手術技術也是成功建立模型的關鍵。

2.1.2 結扎法 包括單純胰管結扎法和十二指腸閉襻結扎法。此方法與人體膽汁回流引起的AP類似。其基本理論基礎是“胰酶自身消化學說”和“膽管阻塞及共同通路學說”的理論，機制為膽胰管腔內壓力增高，使膽汁反流入胰管，膽汁破壞了胰管上皮的黏膜屏障，反流入胰管的膽汁卵磷脂被胰液的磷脂酶A分解為可破壞細胞膜和導管的溶血卵磷脂，胰內蛋白酶被激活，導致胰腺組織的自我消化，造成胰腺水腫、出血和壞死。具體操作是:剖腹后，結扎進入十二指腸的胰膽管或單獨結扎胰管。1957年，Pfeffer等［15］首先提出了十二指腸閉襻結扎法，結扎十二指腸乳頭近、遠兩端腸腔導致十二指腸內容物(膽汁、胰液和腸內容物)反流入閉襻環，反流入膽胰管，可誘導不同嚴重程度的AP，但是可并發高度胃潴留。Foitzik等［16］還認為反流的內容物往往易被細菌感染，動物易引起靜脈瘀血和腸缺血而死于難治性的敗血癥，并且結扎的腸管易引起梗阻和缺血壞死。后來有研究者對此法進行了改進［17］，把十二指腸近端離斷兩端閉合，結扎膽總管，胃與遠端十二指腸吻合，使胰液流入閉襻，隨其內壓的增高而發生反流，形成急性壞死性胰腺炎。結扎法優點是具有臨床意義，是符合人類急性膽源性胰腺炎發病機制的理想模型。但是操作復雜，容易造成腸梗阻，甚至腸管缺血性壞死，且胰腺壞死可逆性差，動物病死率高。

2.1.3 胰腺被膜下注射法 薛建國等［18］用濃度為5%的ST 1 mL/kg，從胰尾部開始被膜下多點緩慢均勻注入，0.5 h后出現胰腺明顯充血水腫及少量腹水，2 h后胰腺部分壞死。Liu等［19］用濃度為3.8%的ST 1 mL/kg被膜下注射成功復制重癥AP模型。被膜下注射法的機制是胰腺被膜下注射ST后，早期直接化學刺激引起被膜下胰腺組織損傷，后期膽鹽激活胰酶產生自身消化，使胰腺進一步損害。此方法簡單，易于操作，省時省力，可快速大批地建立AP動物模型，此外病程進展緩慢，病死率相對較低，適用于觀察病程進展及評價藥物治療效果。缺點是易損傷被膜下血管導致出血，影響模型損傷的評價。

2.2 非侵入性方法

2.2.1 L-精氨酸腹腔注射法 1984年，Mizunuma等［20］首次通過單劑量腹腔注射L-精氨酸(5.0 g/kg)建立急性壞死性胰腺炎模型。此后研究者在不同劑量對實驗動物造成的影響方面進行了大量研究，認為最有效的計量為 2.5～ 5.0 g/kg［21］。一次大劑量注射L-精氨酸即可引起急性壞死性胰腺炎，但是有時需要多次注射，胰腺損傷程度取決于注入的量。給予低劑量的L-精氨酸(2.5 g/kg)組織學會發生輕度變化，包括間質水腫、炎性細胞浸潤、腺泡細胞脫顆粒［22］。單次大劑量的注入 L-精氨酸(4.5 g/kg)會出現腺泡細胞的破壞［23］。L-精氨酸腹腔注射法的機制尚不明確，可能為其毒性抑制鳥氨酸脫氫酶，阻止了核酸的合成，從而干擾了蛋白質的合成，而胰腺細胞蛋白質的合成極為活躍。因此，極易受損傷。此外，其機制還認為和一氧化氮、脂質過氧化、氧自由基密切相關。此法的優點是相對無創傷、操作簡單、費用低廉、易控制、對其他臟器如肝、腎、肺損傷較小，適用于AP各階段病變機制和防治的研究。缺點是臨床意義較差。

2.2.2 雨蛙素注射法 當向實驗動物給予大量的促分泌素時會促使消化酶大量產生，從而導致AP。現在促分泌素多使用膽囊收縮素的模擬物雨蛙素，其具有較強刺激膽囊收縮和胰酶分泌的作用。Lampel等［24］首次用雨蛙素注射法成功復制了AP模型。此后雨蛙素在復制AP模型中廣泛運用。雨蛙素的給藥途徑可通過腹腔注射(50 μg/kg)、靜脈注射(5 μg/kg)或者皮下注射(50 μg/kg)。損傷的程度由注射量來控制，一般損傷程度較輕，多為急性水腫型胰腺炎，大劑量多次注射可引起急性壞死性胰腺炎。Sarmiento 等［25］每小時皮下注射雨蛙素 20 μg/kg，連續注射4 h，成功復制了AP模型。李全生等［26］以雨蛙素腹腔注射(50 μg/kg)，每小時注射1次，共7次，成功復制了急性壞死性胰腺炎模型。雨蛙素注射法的機制尚未完全闡明，現認為可能是其刺激胰腺導致胰液過度分泌和胰液內胰蛋白酶活性增加所致。此法優點為誘導迅速、相對無創傷、重復性高、適用性強、符合人類AP的早期表現，也是AP引起肺損傷的理想模型。但是雨蛙素價格昂貴、臨床意義一般。

2.2.3 喂飼法 1975 年，Lombardi等［27］首次用0.5%無膽鹽乙硫氨酸喂食小鼠復制出急性出血性胰腺炎伴大量脂肪壞死。4 d后病死率為100%，腹腔內脂肪壞死不斷進展，亦可出現腹水、缺氧、低血容量、酸中毒等癥狀。無膽堿乙硫氨酸喂飼法的機制尚不明確，可能為乙硫胺酸干擾了胰腺RNA、蛋白質、磷脂代謝，膽堿不足使得這種作用得到加強，進一步加重病情。雌激素在這一過程中也起到一定作用，因為無膽堿乙硫氨酸喂食對雌鼠敏感。該法優點:非創傷、對內環境影響小、與人體AP生理過程相似。但是該方法只限用于小動物，雄鼠對無膽堿乙硫氨酸喂飼不敏感，病程較長，有高血糖和低血鈣等明顯內分泌紊亂，直接損傷大腦肝臟、不適合研究AP引起的多器官功能障礙綜合征。

2.3 其他方法 包括電針刺激法、離體胰腺灌流法、病毒感染法、免疫法等，但是由于存在顯著的缺點，目前應用不是很廣泛。鑒于各種方法各有其弊端，有學者嘗試聯合法，Kleinhans等［28］靜脈注射雨蛙素聯合腹腔注射脫氧膽酸成功復制了重癥AP模型。Hartwig等［29］逆行胰膽管注入脫氧膽酸氫氧化鈉緩沖液進聯合靜脈注射雨蛙素成功誘導重癥AP模型。聯合法揚長避短，結合了各種方法的優點，目前使用越來越廣泛。

4 結語

各種模型都各有其優缺點，目前尚無一種模型與人類AP的病理生理及發病機制完全一致，近年來對于建立AP模型進行了廣泛的研究，已經大大提高了與人類AP的相似度，研究者可根據自己的研究目的來選擇不同的模型。在對于AP模型不斷完善的同時，人們對AP的機制、病理生理及治療等方面的認識必將得到更進一步的提升。

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