糖尿病足內皮祖細胞治療現狀

彭 艷，程 培(綜述)，徐 勇(審校)

(1.瀘州醫學院附屬醫院內分泌代謝科，四川瀘州646000;2.宜賓市二醫院綜合內科，四川宜賓644000)

糖尿病足是糖尿病最嚴重的并發癥和非外傷性截肢的主要原因。與普通人群相比，糖尿病患者下肢截肢的概率要高出15～40倍，成人中40%的足和下肢截肢為糖尿病所致。老年人的危險性更高，據報道，50歲以上的糖尿病患者下肢血管病變的發生率為25%～30%。由于糖尿病足預后差，最終的結局是潰瘍、截肢、死亡“三部曲”，所以糖尿病足正成為威脅人類健康的世界性公共衛生問題［1］。傳統的藥物治療、血管搭橋及支架置入的遠期療效均不理想，尤其是下肢動脈流出道閉塞而且缺乏代償性側支循環的患者，采用現有的手段都難使血管再通，足部壞疽時截肢往往是患者和醫師的唯一選擇，有些患者截肢后仍危及生命，因此，進一步研究糖尿病足的有效治療方法有重要的理論和現實意義。

1 糖尿病足發病機制與一般治療

糖尿病足的發生與神經病變、血管病變和感染有關。其中血管病變在糖尿病發病與難以恢復中起著重要作用。

目前糖尿病足的治療針對其發病機制大致有治療神經病變的藥物如彌可保等，或者體外反搏理療;改善動脈硬化及循環使用前列腺素E1、中藥、他汀類藥等;控制感染使用抗生素及局部處理傷口。局部處理傷口也采用了很多方式，如清潔傷口的超聲刀、負壓吸引;使傷口創面肉芽容易生長的各種敷料與血小板凝膠。也有改善循環的血管搭橋與支架置入。以上治療方法大都效果不佳，僅能暫時或者局部解決問題，臨床需要更多更有效的血管病變的治療方法。

2 內皮祖細胞治療血管缺血

由于血管病變在糖尿病足中起著至關重要的作用，治療血管病變改善循環成為治療糖尿病足的關鍵問題。糖尿病不僅能促進血管病變而致嚴重缺血性疾病，而且同時伴有側支血管形成能力嚴重受損使其不易恢復。糖尿病血管病變以側支血管形成能力嚴重受損為特征，這就需要改善側支循環，建立新生血管。血管新生過程包括血管形成和血管生成。血管形成是指胚胎期血管內皮前體細胞形成血管網絡，而血管生成是指在原有血管的基礎上內皮細胞增殖而形成新的血管網。血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)具有自我增殖、定向歸巢的特性，可定向分化為血管內皮細胞，促進血管新生，修復損傷內膜。要全面、長久改善糖尿病下肢缺血，內皮祖細胞移植是一種值得期待的治療方式。

EPC至今尚無一個明確的定義，現在的EPC被定義為表達干細胞表面標志物(如CD34或CD133)和內皮標志物雙陽性的細胞群。成人后骨髓、臍血、以及外周血中都可以分離出EPC。EPC分為兩種類型:早期和晚期，早期4～7 d形成中央為圓形細胞周圍為梭形細胞的典型的放射狀集落。晚期為2～3周出現的EPC，呈鵝卵石樣的集落。有研究表明兩類EPC移植在促血管新生方面效果相當［2］。研究發現，EPC不僅參與人胚胎血管生成，同時也參與出生后血管新生和內皮損傷后的修復過程，也可遷移到其他缺血、炎癥及腫瘤組織中，形成新生血管［3］。EPC在血管方面的功能主要有:參與出生后的血管新生;參與炎癥損傷修復;參與損傷血管修復;維持內皮細胞的完整和血管的動態平衡［4］。

3 糖尿病足與內皮祖細胞治療

3.1 糖尿病與內皮祖細胞 血管損傷后除局部血管壁細胞參與損傷血管修復外，外周血及骨髓中的EPC也參與修復過程［5］。但是糖尿病患者外周血中EPC數量較非糖尿病者明顯減少，長期高血糖可導致EPC功能受損，血管形成和血管新生作用減弱，EPC數量、增殖能力與糖化血紅蛋白、糖尿病病程呈負相關，高血糖濃度、持續時間對EPC數量、增殖能力有決定性影響［6］。糖尿病導致血管內皮生長因子通路上任一環節受損均影響缺血誘導的EPC動員。糖尿病患者組織表皮細胞和肌纖維母細胞表達趨化因子減少，可能是EPC歸巢減少的原因［7］。由于糖尿病患者的外周循環中EPC的數量與功能明顯下降，通過自體EPC動員難以達到治療的目的。因此將EPC進行體外培養和擴增并進行一定的基因修飾，移植到患者體內，可能是治療糖尿病血管病變的理想手段。利用健康人外周血EPC能夠有效地修復損傷的糖尿病患者視網膜血管［8］。在臨床常發現存在缺血性血管形成受損的糖尿病患者常伴有視網膜的血管新生，即“糖尿病矛盾現象”。但Losordo等［9］觀察了900余例接受過治療性血管新生的糖尿病患者，并未發現EPC移植能增加糖尿病視網膜病變的發病率或加重糖尿病視網膜病變的進展。

3.2 糖尿病足內皮祖細胞治療 內皮祖細胞移植到糖尿患者的下肢，在肢體缺血這種特定的環境下，分化出大量的內皮細胞的內皮祖細胞，內皮祖細胞分裂、增殖、產生出大量成熟的內皮細胞，再經過有序的排列形成血管，發生新的側支循環，增加患足的血液灌注。于是利用內皮祖細胞的這種特性應用于治療糖尿病足成為可能。內皮祖細胞分為骨髓內皮祖細胞，外周血內皮祖細胞，臍血內皮祖細胞，前兩種細胞移植治療糖尿病下肢缺血的研究較多。

2001年日本Eriko等［10］最早報道應用自體骨髓內皮祖細胞移植治療下肢缺血，他們用自體骨髓單個核細胞移植(直接腓腸肌內注射)治療了45條下肢缺血性疾病，其中39條下肢的癥狀得到改善，30條下肢的踝肱指數的增加幅度超過了0.1，數字減影顯示有明顯的側支血管生成。該實驗未出現任何相關的并發癥，臨床安全性和有效性都得到了初步肯定。國內宣武醫院谷涌泉等［11］采用自體骨髓干細胞移植治療慢性下肢缺血94例，采用非隨機對照實驗，入選病例包括糖尿病下肢缺血病變、單純下肢動脈閉塞硬化、脈管炎等，采用動脈腔內注射內皮祖細胞及小腿局部肌肉注射內皮祖細胞兩種方法，觀察間歇性跛行的改善、疼痛改善、冷感評分、踝肱指數、經皮氧分壓測定、數字修改減影等主客觀指標，得出結論:自體骨髓干細胞移植治療下肢缺血患者，適合病變的早、中期階段，但對于缺血晚期特別是患肢存在組織壞疽者的治療效果仍有待進一步提高。陳兵等［12］應用自體骨髓間充質干細胞體外擴增后移植治療糖尿病足，自體骨髓間充質干細胞移植后患足癥狀明顯緩解、踝肱指數顯著上升、側支血管增多，與常規治療組相比存在顯著性差異。同時細胞移植組所有患者創面(包括潰瘍、瘺道、2例足趾壞疽行手術切除者)在治療后2～4周內均完全愈合，較常規治療組提前3～4周的時間。

黃平平等［13］最早在國際上開展自體外周血干細胞移植治療下肢缺血，對1例確診為嚴重下肢動脈硬化性閉塞癥患者，應用自體外周血干細胞移植移植，3個月后發現，患肢冷感、疼痛、間歇性跛行、潰瘍明顯好轉，數字減影下肢動脈造影結果顯示新側支血管形成明顯增加。2000年 Kalka等［14］將人 EPC在體外擴增后經心腔注入股動脈結扎的裸鼠體內后28 d，缺血肢體的血流量恢復至手術前的70%，組織切片證實人EPC參與了新血管的形成。王富軍等［15］利用自體外周血干細胞移植治療缺血性下肢血管病取得了很好的療效，未發現不良反應，不少國外學者也有類似報道。

3.3 糖尿病足與臍血內皮祖細胞治療 相比骨髓內皮祖細胞與外周血內皮祖細胞，臍血內皮祖細胞具備自我更新和增殖的能力，并能在特定因素的影響或誘導下向各種細胞或組織分化。而且臍血來源容易，成本低廉，采集過程簡單無痛苦，臍血EPC數量和質量較優，其中干(祖)細胞濃度是外周血的10～20倍，細胞增殖能力也較強，且其配型要求較低，因此，臍帶血內皮祖細胞因獨特優勢受到越來越多科學家的青睞。

CD34抗原是造血干細胞分離純化的主要標志。臍血中CD34+細胞約占有核細胞的1%，所占比例與骨髓相似，高于外周血，其中早期造血前體細胞CD34+CD38－和CD34+Thy－1+lin－亞群比例高于骨髓和外周血。臍血中的紅系集落形成單位的數量也高于成人外周血及骨髓。骨髓中也可檢測到高增殖潛能集落形成細胞，但其檢出頻率只有臍血的1/8。臍血中低表達或不表達細胞凋亡配基CD95Fas，因此其壽命更長。臍血富含各系造血干細胞，比骨髓、外周血更原始，具有更高增殖潛能。能耐受更大程度上的HLA(人類白細胞抗原)配型不符等生物學特性［16］。更易找到HLA相合的無關供者，抗原表達弱，淋巴細胞的細胞毒性低，臍帶血中不會有腫瘤細胞。臍血富含CD34和CD133共同表達的EPC［17］。收集方法簡單，可做到完全無菌，耐冰凍，可長期保存。Yang等［18］證實從臍血CD133細胞中可誘導出內皮祖細胞，表現為表達內皮細胞標志的貼壁細胞，移植后的內皮祖細胞可以在缺血組織分化成內皮細胞，整合到缺血部位新生血管內，移植EPC后裸鼠缺血后肢的毛細血管密度、血流灌注及壞死程度均較對照組明顯改善。徐建萍等［19］發現臍血單個核細胞在血管內皮生長因子等細胞因子的誘導下可定向分化為內皮細胞。Kim等［20］應用臍血內皮祖細胞移植治療Buerger病，結果顯示:細胞移植后患者靜息痛緩解，肢體皮膚潰瘍4周愈合，血管阻力降低。血管造影顯示肢體遠端毛細血管密度增加、直徑加大。因此臍血內皮祖細胞具有應用于臨床治療糖尿病足的可能性，臍血作為一種改善循環的干細胞庫具有其獨特優勢。

4 問題與展望

內皮祖細胞為治療糖尿病足提供了有效方式，應用前景廣闊，但也存在一些問題需要解決。內皮祖細胞常常取材量較小，異體間存在排斥反應的可能。移植后的內皮祖細胞是否會在移植部位分化為其他組織細胞，如骨組織或出現腫瘤樣生長?是否會促進體內潛在惡性腫瘤及血管瘤的生長?是否會促進糖尿病眼底病變的惡化導致失明，或者相反?是否在促進肢體側支循環的同時又改善了心肌缺血、腦缺血?所有這些均有待進一步研究。對于注射方式是缺血局部還是靜脈注射效果更佳?靜脈注射有無不良反應?注射細胞最適劑量是多少?這些技術問題也有待進一步探討。由于臍血內皮祖細胞有其獨到優勢，對于臍血內皮祖細胞治療糖尿病足進行深入研究將可能給糖尿病足患者的治療和預后帶來希望。

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