咽舒飲合劑微生物限度檢查方法驗證

劉倩，鄭國華，程璐，張耕

(1.湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065;2.武漢市第一醫院制劑中心，430022)

咽舒飲合劑是武漢市第一醫院的醫院制劑(批準文號:鄂藥制字Z20082959)，由金銀花、石斛、玄參、淡竹葉、薄荷、射干、麥冬、青果、甘草9味藥材組成，主要功效為清熱解毒，利咽潤喉，臨床上用于治療急慢性咽炎，干燥性咽炎。本制劑為口服制劑，根據其用藥途徑，應進行細菌、真菌和酵母菌的測定及大腸埃希菌的檢查。根據《中華人民共和國藥典》2010年版一部微生物限度檢查法規定［1］，應進行細菌、真菌及酵母菌計數方法和控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的細菌、真菌及酵母菌數的測定和控制菌的檢查。筆者查閱有關文獻［2-3］，并進行多次實驗，確定咽舒飲合劑微生物限度的檢查方法，更進一步保證了該制劑的質量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SW-CJ-ICU型標準型凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司);BP2100電子天平(賽多利斯);LRH-150-Ⅱ型生化培養箱(廣東省醫療器械廠);PYX-DHS細菌培養箱(上海市醫療器械一廠);HR40-IIA2生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司);WD-9403C型紫外分析儀(北京市六一儀器廠);HTY反復使用集菌培養器(杭州泰林生物技術設備有限公司);HTY-2000A型集菌儀(杭州高得醫療器械有限公司);YX-400Z智能型全自動不銹鋼雙層立式電熱蒸汽壓力消毒器(上海三申醫療器械有限公司)。

1.2 實驗菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44 102］、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)［CMCC(B)26 003］、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］、白念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F)98 001］、黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］，由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.3 培養基與試藥 營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養肉湯培養基、膽鹽乳糖培養基、改良馬丁液體培養基、改良馬丁瓊脂培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養基、曙紅亞甲藍瓊脂培養基均由中國藥品生物制品檢定所提供。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，0.9%無菌氯化鈉溶液。咽舒飲合劑(武漢市第一醫院自制，批號:100318)。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 ①取經35℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營養肉湯培養物毫升，用0.9%無菌氯化鈉溶液配制成每毫升含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用。②取經25℃培養24～48 h的白念珠菌改良馬丁液體培養物1 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液配制成每毫升含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用。③取經25℃培養1周的黑曲霉改良馬丁斜面培養物，加0.9%無菌氯化鈉溶液10 mL洗下真菌孢子，吸取菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液配制成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用。

2.2 供試液制備 取供試品10 mL加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90mL，搖勻，作為1∶10供試液備用。

2.3 細菌、真菌和酵母菌計數方法的驗證

2.3.1 實驗組 取1∶10供試液1 mL，注入微生物限度用薄膜過濾器中，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL沖洗(每次100 mL)，最后一次沖洗液中加入陽性菌50～100 cfu，取出濾膜，菌面向上置相應的培養基貼膜培養，置規定的溫度培養至規定的時間，逐日觀察結果，做菌落計數，測定所加入的試驗菌數，并平行制備3個平皿。

2.3.2 菌液組 取試驗菌50～100 cfu注入平皿中，立刻傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定的溫度培養至規定的時間，逐日觀察結果，做菌落計數，測定所加入的試驗菌數，并平行制備3個平皿。

2.3.3 供試品 對照組取1∶10供試液1 mL，注入微生物限度用薄膜過濾器中，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL沖洗(每次100 mL)，取出濾膜，菌面向上置相應的培養基貼膜培養，置規定的溫度培養至規定的時間，逐日觀察結果，測定供試品本底菌數，并平行制備3個平皿。

2.3.4 稀釋劑 對照組取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 mL注入微生物限度用薄膜過濾器中，用少量沖洗液沖洗，并加入陽性菌50～100 cfu，取出濾膜，菌面向上置相應的培養基貼膜培養，置規定的溫度培養至規定的時間，逐日觀察結果。考查稀釋劑對實驗有無干擾。

2.3.5 回收率的計算 回收率(%)=(實驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數×100%。結果見表1。結果表明，大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白念珠菌和黑曲霉回收率均＞70%［1］，表明咽舒飲合劑對細菌、真菌和酵母菌的生長無抑制作用。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋劑的稀釋劑對照組回收率超過70%，表明稀釋劑無抑菌作用，對試驗無干擾。可采用該方法對咽舒飲合劑進行細菌、真菌和酵母菌測定。

表1 咽舒飲合劑細菌、真菌和酵母菌回收率的測定cfu·mL-1

2.4 控制菌檢查方法的驗證

2.4.1 供試液的制備 同“2.2”項下。

2.4.2 實驗組 取1∶10供試液10 mL薄膜過濾，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL沖洗(每次100 mL)，取出濾膜加至100 mL膽鹽乳糖培養基中，同時加入大腸埃希菌液50～100 cfu，置35℃培養24 h。取上述培養物0.2 mL接種至含MUG培養基5 mL的試管中培養，分別于5，24 h在366 nm波長紫外線下觀察熒光，然后進行靛基質實驗，觀察結果;另取培養物劃線接種于曙紅亞甲藍平板，35℃培養18～24 h，觀察其菌落形態。

2.4.3 陰性菌對照組 取1∶10供試液10 mL薄膜過濾，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 mL沖洗(每次100 mL)，取出濾膜加至膽鹽乳糖培養基100 mL中，同時加入上述金黃色葡萄球菌 50～100 cfu，置35℃培養24 h。取上述培養物0.2 mL，接種至含MUG培養基5 mL的試管中培養，分別于5，24 h在366 nm波長紫外線下觀察熒光，然后進行靛基質實驗，觀察結果;另取培養物劃線接種于曙紅亞甲藍平板，35℃培養18～24 h，觀察其菌落形態。結果見表2。結果表明，按該方法檢查咽舒飲合劑對大腸埃希菌的生長無抑制作用，可采用該方法對咽舒飲合劑進行大腸埃希菌控制菌的檢查。

表2 兩組大腸埃希菌檢查方法驗證結果

3 討論

由于咽舒飲合劑中含有金銀花，金銀花水提取物對金黃色葡萄球菌菌、大腸埃希菌、枯草桿菌、青霉菌、黃曲霉、黑曲霉等均有抑菌作用［4-5］，并提示提取溫度、時間、抽提比等對結果有影響;對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、甲(乙)型鏈球菌，尤其是金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯［6］;對金黃色葡萄球菌菌、大腸埃希菌、變形鏈球菌等有良好的抗菌活性［7］;所以采用薄膜過濾法去除制劑本身的抑菌活性。沖洗液的用量以200，300，400，500 mL進行研究驗證，最終確定為300 mL，可以消除制劑本身的抑菌活性，菌回收率均達標，且不會由于沖洗液用量過大造成濾膜上微生物受損死亡。

方法驗證所用菌株選擇的原則［1］:選擇代表性、普遍性、低或非致病性的標準菌株。菌種傳代次數不超過5代，采用適宜的方法保存，應防止變異。菌液濃度控制50～100 cfu之間。且為保證每次實驗菌數一致性，應將制備好的菌液置于4℃冰箱內保存一定時間，另外制備好的菌懸液存放時間不超過6 d時可以連續使用，時間超過1周，其含菌數可能超出范圍。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄216-219.

［2］ 張玉蘭，洪建文，羅翰宇.復方丹參片微生物檢查限度方法的建立［J］.中藥材，2005，28(8):728-730.

［3］ 劉炳茹，董利霞，乙靜平.五種蒙成藥微生物限度檢查的方法驗證［J］.中國民族醫藥雜志，2006，5(2):58-59.

［4］ 趙良忠.金銀花水溶性抗菌物質的提取及其抑菌效果研究［J］.中國生物制品學雜志，2006，19(2):201-203.

［5］ 程璐，徐宏峰，張耕.高效液相色譜法測定咽舒飲合劑中綠原酸的含量［J］.醫藥導報，2009，28(1):105-107.

［6］ 宋海英.金銀花的體外抑菌作用研究［J］.時珍國醫國藥，2003，14(5):269.

［7］ 張紅鋒.中藥金銀花提取物的體外抑菌作用［J］.華東師范大學學報，2000，1(1):107-108.