榅桲子總黃酮提取工藝研究*

哈及尼沙，地力夏提·艾比布拉，美麗萬·阿不都熱依木，阿吉艾克拜爾·艾薩

(1.中國科學院新疆理化技術研究所，烏魯木齊 830011;2.中國科學院研究生院，北京 100049;3.新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 830054)

榅桲(Cydonia Oblonga)是維吾爾醫常用的具有濃郁的地方民族色彩的傳統維藥。榅桲子有強化皮膚保濕力，光滑皮膚，退燒，止咳，降低干躁等作用［1-4］，在維吾爾醫中常用主治干熱性或膽液質性疾病，如:發熱舌燥、傷寒、肺結核、咳嗽、感冒、腸瘍腹瀉等［5］。據文獻報道［6-8］，榅桲子含有黃酮類及酚類成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗潰瘍和抗腫瘤等活性。目前筆者還未見該藥材總黃酮含量測定及提取工藝研究的報道。為了該藥材的進一步研究，在參考《中華人民共和國藥典》及文獻中總黃酮測定方法的基礎上［9］，采用乙醇提取，紫外可見分光光度法首次測定維藥榅桲子中總黃酮含量，得到最佳提取工藝條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平(北京賽多利天平有限公司)，UV-2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司)，XMT-DA型電子恒溫水浴鍋(余姚市亞星儀器儀表有限公司)。

1.2 試藥 蘆丁化學對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:100080-200707，純度:92.5%)，亞硝酸鈉(天津市福晨化學試劑廠)，氫氧化鈉(天津市紅巖化學試劑廠)，硝酸鋁(天津市福晨化學試劑廠)，無水乙醇(天津市紅巖化學試劑廠)等試劑均為分析純。

榅桲于2009年10月采自新疆克拉瑪依州上阿圖什鄉，榅桲子從該新鮮成熟榅桲果實中分離、室溫下干燥。將干燥種子粉碎，過篩孔內徑(180.0±7.6)μm(80目)篩，得榅桲子粉末。并由新疆維吾爾自治區藥品檢驗所蘇萊曼主任藥師鑒定為榅桲子。

2 方法與結果

2.1 榅桲子總黃酮的測定

2.1.1 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁標準品25 mg，加75%乙醇超聲完全溶解，定容至100 mL量瓶中，搖勻，制成濃度為0.250 mg·mL-1的標準品溶液。分別精密吸取標準品溶液 0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 和7.0 mL置于25 mL量瓶中，各加5%亞硝酸鈉0.5 mL，放置6 min后，加8%硝酸鋁0.5 mL，放置6 min，再加1 mol·L-1氫氧化鈉 5 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加標準品的溶液作空白，取中等濃度的標準溶液在400～800 nm波長范圍進行掃描，在506.5 nm波長處有最大吸收。最大吸收波長處測定各標準溶液的吸光度值，以吸光度(Y)為縱坐標，濃度(X，mg·mL-1)為橫坐標，繪制標準曲線。用計算機進行線性回歸，得蘆丁質量濃度和吸光度的關系為:Y=7.754 5X+0.066 3，r=0.999 7。在吸光度＜0.5的范圍內，吸光度和濃度保持較好的線性關系。

2.1.2 榅桲子總黃酮含量的測定 稱取一定量榅桲子粉末，用適量75%乙醇回流2 h，抽濾后濾液置于50 mL量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，搖勻。取此樣品液5.0 mL置于25 mL量瓶中，然后按“2.1.1”方法測定提取液的吸光度，通過標準曲線計算得到樣品總黃酮的含量。總黃酮含量=榅桲子中總黃酮提取量/榅桲子質量。

2.2 單因素實驗及水平考察 將原料榅桲子粉末按1∶10～1∶35(倍)的料液比加入濃度為55% ～95%乙醇溶液，然后在溫度30～70℃條件下提取0.5～3 h，1～4次，每次改變其中1個因素，分析該因素對提取量的影響。用單因素實驗來確定總黃酮最佳提取條件。

由于各因素之間有相互交叉影響，因此要全面考慮乙醇提取法的工藝參數，采用L9(34)正交設計表安排實驗，以總黃酮提取量作為主要考察指標。

2.3 實驗與結果

2.3.1 乙醇濃度對提取量的影響 精密稱取榅桲子5份，每份5.00 g，分別取體積分數為55%，65%，75%，85%和95%乙醇溶液各100 mL，在60℃水浴中回流提取2 h，趁熱過濾，冷卻后，按照“2.1.2”方法計算黃酮含量，結果黃酮含量分別為 4.00，10.25，10.50，7.75 和5.75 mg·g-1。實驗結果表明:隨著乙醇濃度的增加，總黃酮含量降低。低濃度乙醇中水分含量較多，可促進植物在水中的膨脹，提高植物和溶劑的接觸面。從實驗中也可以看出:乙醇濃度為75%時黃酮含量最高，所以75%乙醇選為最佳乙醇提取濃度。

2.3.2 提取時間對提取量的影響 精確稱取榅桲子藥材粉末6份，每份5.00 g，在料液比為1∶20的提條件下，加75%乙醇溶液，在60℃水浴中分別回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 和 3.0 h，趁熱過濾，冷卻后按照“2.1.2”的方法計算黃酮含量，結果黃酮含量分別為6.75，8.00，8.25，9.50，9.75 和8.25 mg·g-1。實驗結果表明:當提取時間為2.5 h時，提取效果最好。而當時間繼續延長時，總黃酮含量反而降低。這可能是由于提取時間太長，部分乙醇被揮發而導致溶液沸點逐漸增大，從而破壞某些黃酮類化合物。

2.3.3 料液比對提取量的影響 精確稱取榅桲子藥材粉末6份，每份5.00 g，分別加75%乙醇溶液，料液比(倍)分別為 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 和1∶35，在75℃水浴中回流提取2 h，趁熱過濾，冷卻后，按照“2.1.2”的方法計算黃酮含量，結果黃酮含量分別為 6.25，9.50，5.25，6.50，6.75 和 7.00 mg·g-1。從實驗結果可知:料液比1∶15(倍)時總黃酮提取量最高，因此選擇料液比1∶15(倍)為最佳提取料液比。

2.3.4 提取溫度對提取量的影響 精確稱取榅桲子藥材粉末7份，每份5.00 g，乙醇濃度為75%，料液比為1∶15，分別在30，40，50，60，70，80 和 90 ℃恒溫水浴中回流2 h。趁熱過濾，冷卻后，按照“2.1.2”方法進行黃酮含量的測定。結果黃酮含量分別為2.25，3.75，5.75，8.25，9.00，5.55 和 7.25 mg·g-1。實驗結果表明:70℃時總黃酮含量最大，黃酮在乙醇中的溶解度隨著溫度的升高而增大，但溫度＞70℃時發現含量走勢不穩定。溫度太高有可能破壞黃酮類化合物的結構，可能溶劑揮發率增加而影響黃酮的提取量，所以初步選70℃為最佳提取溫度，進一步用正交實驗來確定最終提取溫度。

2.3.5 提取次數對提取量的影響 精密稱取榅桲子藥材粉末4份，每份5.00 g，以75%乙醇溶液為提取溶劑、料液比為1∶30下，分別在70℃恒溫水浴中回流1，2，3和4次，每次2 h。趁熱過濾，冷卻后按照“2.1.2”的方法進行黃酮含量的測定，結果黃酮含量分別為1.50，5.75，6.50和6.50mg·g-1。實驗結果表明:提取2次以上時總黃酮提取率明顯增高，提取3次時總黃酮含量最高與提取4次的總黃酮含量差別不大，為了節約提取時間選擇提取3次為最佳的提取次數。

2.4 正交實驗設計及結果 榅桲子總黃酮的提取量受到很多因素的影響，根據單因素預實驗分析，發現提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)、乙醇濃度(D)對榅桲子總黃酮的提取量均有影響。由于各因素之間有相互交叉影響，要全面考慮乙醇提取法的工藝參數。通過以上單因素實驗，找出最佳單因素，在最佳單因素數據的基礎上，采用L9(34)正交設計表安排實驗，以總黃酮提取量作為主要考察指標。因素和水平見表1，實驗方案及結果見表2，方差分析見表3。

表2 L9(34)正交設計實驗的結果Tab．2 Results of L9(34)orthogonal test

表3 4因素方差分析Tab．3 Variance analysis of 4 factors

從表2中的 K1，K2，K3，R 分析得到:乙醇濃度，提取時間，料液比，提取溫度4種因素對榅桲子總黃酮提取的影響程度依次為:乙醇濃度 (D)＞料液比(C)＞提取時間(B)＞提取溫度(A)。比較各因素的極差R可知，料液比和乙醇濃度的極差較大，說明它們對總黃酮的提取量影響較為顯著;而提取時間和提取溫度的極差較小，說明對總黃酮提取量的影響較小。總黃酮的提取量隨乙醇濃度先升高，而后有所下降，在75%時提取量最高，濃度＞75%時提取量下降，可能是由于乙醇濃度過大時，在加熱條件下，溶劑揮發從而較多損失的緣故。

由表3可知，料液比和乙醇濃度在置信度95%水平上對提取量影響顯著。通過以上綜合分析，結合單因素實驗和極差分析，確定最佳提取工藝為A2B3C1D2，即提取溫度為60℃，提取時間2.5 h，料液比1∶10，乙醇濃度75%，提取3次。

2.5 驗證實驗 按照正交實驗確定的最佳工藝:提取溫度為60℃，提取時間2.5 h，料液比1∶10，乙醇濃度75%的條件下，重復3次進行實驗，得到的平均提取量為13.60 mg·g-1。3次重復實驗的結果之間相差很小，說明該工藝穩定可靠，可作為有機溶劑提取榅桲子的最佳工藝。

3 討論

根據單因素實驗，確定榅桲種子中總黃酮的提取條件為:乙醇濃度75%，提取時間2.5 h，料液比1∶15，提取溫度70℃，提取次數3次。各因素之間有相互交叉影響，在單因素實驗結果的基礎上采用L9(34)正交設計實驗，考慮乙醇提取法的工藝參數。正交實驗結果顯示，影響總黃酮提取量的因素主次順序為:乙醇濃度＞料液比＞提取時間＞提取溫度。確定提取條件為75%乙醇作溶劑，料液比1∶10，溫度為60℃，提取3次，每次提取時間2.5 h，得到榅桲子中黃酮類物質總含量為13.60 mg·g-1。根據驗證實驗，該提取工藝穩定性好，可靠。

本實驗采用分光光度法，以蘆丁為標準對照品，測定榅桲子中總黃酮含量，選擇最佳提取工藝條件。該方法操作簡便，成本低，提取效果好，可用于檢測榅桲子中黃酮含量，為該藥材的進一步系統研究提供了依據。

(志謝:感謝“中國科學院、國家外國專家局創新團隊國際合作伙伴計劃”項目和國家杰出青年基金項目的資助)

［1］ 新疆植物志編輯委員會.新疆植物志:第2卷，第2分冊［M］.烏魯木齊:新疆科技衛生出版社，1995:287.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準維吾爾藥分冊［M］.烏魯木齊:新疆科技衛生出版社，1999:105.

［3］ 尼米吐拉·艾白都拉，買買提江·馬合木提，木塔力甫·艾力.維吾爾醫常用藥材(維吾爾文)［M］.烏魯木齊:新疆人民衛生出版社，2005:133.

［4］ 中國醫學百科全書編輯委員會.中國醫學百科全書·維吾爾醫學［M］.上海:上海科學技術出版社，2005:259.

［5］ 阿巴拜克熱·熱合曼.維吾爾醫常用生藥［M］.烏魯木齊:新疆人民衛生出版社，2004:118.

［6］ SILVA B M，ANDRADE P B，VALENTAO P，et al.Quince(Cydonia oblanga Miller)fruit(Pulp，Peel，and seed)and jam:antioxidant activity［J］.JAgric Food Chem，2004，52:4405-4712.

［7］ SILVA B M，ANDRADE P B，FERRERES F，et al.Composition of quinec Cydonia oblanga Miller seeds:phenolics，organic acids and amino acids［J］.J Nat Product Res，2005，19(3):275-281.

［8］ ANDREIA PO，JOSE A P，PAULA B A，et al.Cydonia oblonga leaves phenolics［J］.J Agric Food Chem，2007，55(19):7926-7930.

［9］ 王洪倫，李玉林，索有瑞.白刺種子黃酮類化合物最佳提取工藝研究［J］.食品科學，2004，25(7):97-99.