粘魚須威靈仙棉團(tuán)鐵線蓮對非特異性免疫的影響比較*

石強(qiáng)

(德州學(xué)院藥品研究開發(fā)中心，山東德州 253023)

威靈仙是中醫(yī)臨床常用祛風(fēng)濕藥物，用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)不利、四肢麻木，并有治療骨鯁病癥之功效［1］。威靈仙在全國應(yīng)用的品種很多，據(jù)調(diào)查有四科十多種［2］。《中華人民共和國藥典》(2005年版)收載威靈仙系毛茛科鐵線蓮屬植物威靈仙(Clematis chinensis Osbeck.)、棉團(tuán)鐵線蓮(C．hexapetala Pall.)、東北鐵線蓮(C．manshurica Rupr.)的干燥根及根莖。而我國北方諸省長期以百合科植物粘魚須(又名華東菝葜Smilax sieboldii Miq.)的干燥根及根莖作為威靈仙使用［3］。毛茛科鐵線蓮屬植物和粘魚須作為威靈仙入藥均有本草依據(jù)［4］，但科屬不同，藥理作用是否一致，筆者未見報道。筆者研究證實(shí)，粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮三藥具有相似的鎮(zhèn)痛、抗炎、抑制T細(xì)胞功能，抑制小鼠細(xì)胞免疫的作用，對體液免疫無明顯影響［5］。根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)，風(fēng)濕病屬于變態(tài)反應(yīng)性疾病，祛風(fēng)濕與影響機(jī)體的免疫功能有關(guān)。因此，筆者從影響非特異性免疫功能方面再對粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮進(jìn)行比較，為粘魚須能否作為威靈仙入藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材的來源與鑒定 粘魚須(Smilax sieboldi i Miq.)采自青島市嶗山，威靈仙(Clematis chinensis Osbeck.)采自江蘇省江浦縣，棉團(tuán)鐵線蓮(C．hexapetala Pall.)購自德州市藥材站。以上藥材經(jīng)山東省德州市藥品檢驗(yàn)所鑒定為正品，陰干備用。

1.2 藥材水煎液的制備 稱取粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮干燥粉末各100 g，用水煎醇沉法制得提取液，濃縮至100 mL得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%水煎液備用。取100%粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮水煎液各50 mL，分別加入純化水50 mL，混勻得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%水煎液備用［6］。

1.3 藥品與儀器 氫化可的松注射液(秦皇島制藥有限公司生產(chǎn)，批號:040615)，地塞米松磷酸鈉注射液(山東瑞陽制藥有限公司生產(chǎn)，批號:050203)。Olympus雙目顯微鏡(日本生產(chǎn))，752型紫外分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))。印度墨汁、雞紅細(xì)胞懸液(由濟(jì)南市衛(wèi)生防疫站提供)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物 昆明種小鼠，普通級，健康，體質(zhì)量18～22 g，山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［7］。取小鼠80只，雌雄兼用，隨機(jī)分成8組，每組10只。其中6組灌胃給予受試藥物，陽性對照組灌胃給予氫化可的松溶液，空白對照組灌胃給予0.9%氯化鈉溶液。劑量見表1，qd，連續(xù)7 d(氫化可的松組連續(xù)5 d)。末次給藥后次日，每鼠尾靜脈注射印度墨汁0.05 mL·(10 g)-1。注射后1 min(t1)和5 min(t5)，用吸管分別從眼眶靜脈叢取血20μL，溶于0.1%碳酸鈉溶液2 mL中搖勻，在680 nm波長下比色，測定吸光度(A值)，分別用A1和A5表示1和5 min所取血樣的A值，計算K值。K=lg(A1/A5)/(t5-t1)，然后把小鼠脫臼致死，取肝和脾臟分別稱質(zhì)量，求α值。α=體質(zhì)量/(肝質(zhì)量+脾質(zhì)量)×K。

1.5.2 對腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［7］。取小鼠80只，雌雄兼用，隨機(jī)分成8組，每組10只。其中6組灌胃給予受試藥物，陽性對照組灌胃給予地塞米松，空白對照組灌胃給予0.9%氯化鈉溶液。劑量見表2，qd，連續(xù)7 d(地塞米松組連續(xù)5 d)。給藥第3天，每只鼠腹腔注射0.5%淀粉0.9%氯化鈉溶液(腹腔巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑)0.5 mL。末次給藥的當(dāng)日每鼠腹腔注射2%雞紅細(xì)胞懸液1mL，處死小鼠，經(jīng)腹膜注入0.9%氯化鈉溶液2 mL，轉(zhuǎn)動鼠板1 min，吸出腹腔洗液1 mL，滴于載玻片上，37℃溫孵30 min，用0.9%氯化鈉溶液沖去未貼壁細(xì)胞，甲醇固定，姬-瑞氏混合液染色。鏡下計數(shù)100個巨噬細(xì)胞，按下式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率(%)=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/100個巨噬細(xì)胞×100%。吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/100個巨噬細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠碳粒廓清的影響 結(jié)果見表1。由表1可知，粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮大劑量組的K值和α值均低于空白對照組，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);3種藥物的小劑量組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但也呈現(xiàn)出降低K值和α值的趨勢，提示3種藥物有相似的降低K值和α值的作用。3種藥物相應(yīng)劑量組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果見表2。由表2可知，粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮2個劑量組的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均低于空白對照組，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)，提示三種藥有相似的降低吞噬百分率和吞噬指數(shù)的作用。三種藥相應(yīng)劑量組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮對小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Tab．1 The effects of Sm ilax sieboldii M iq．，Clematis chinensis Osbeck．a(chǎn)nd C．hexapetela Pall on mononuclear macrophage phagocytosis ofm ice ±s

表1 粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮對小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Tab．1 The effects of Sm ilax sieboldii M iq．，Clematis chinensis Osbeck．a(chǎn)nd C．hexapetela Pall on mononuclear macrophage phagocytosis ofm ice ±s

與空白對照組比較，*1 P＜0.05，*2 P＜0.01Compared with the blank control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

組別 藥物 劑量/(g·kg-1) 小鼠/只 K值 α值粘魚須小劑量組 50%粘魚須水煎液 10 10 0.068±0.020 6.703±0.912大劑量組 100%粘魚須水煎液 20 10 0.060±0.011*1 6.621±0.705*1威靈仙小劑量組 50%威靈仙水煎液 10 10 0.062±0.026 7.426±0.716大劑量組 100%威靈仙水煎液 20 10 0.047±0.013*2 6.422±0.461*2棉團(tuán)鐵線蓮小劑量組 50%棉團(tuán)鐵線蓮水煎液 10 10 0.069±0.030 6.997±0.522大劑量組 100%棉團(tuán)鐵線蓮水煎液 20 10 0.059±0.013*1 6.695±0.539*1陽性對照組 氫化可的松 0.066 10 0.031±0.006*2 5.591±0.834*2空白對照組 0.9%氯化鈉溶液 …10 0.075±0.018 7.434±0.812

表2 粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Tab．2 The effects of Sm ilax sieboldii M iq．，Clematis chinensis Osbeck．a(chǎn)nd C．hexapetela Pall on peritonealmacrophage phagocytosis ofm ice ±s

表2 粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響Tab．2 The effects of Sm ilax sieboldii M iq．，Clematis chinensis Osbeck．a(chǎn)nd C．hexapetela Pall on peritonealmacrophage phagocytosis ofm ice ±s

與空白對照組比較*1 P＜0.01Compared with the blank control group，*1 P ＜0.01

組別 藥物 劑量/(g·kg-1) 小鼠/只 吞噬百分率/%吞噬指數(shù)粘魚須小劑量組 50%粘魚須水煎液 10 10 18.2±8.3*1 0.29±0.14*1大劑量組 100%粘魚須水煎液 20 10 15.4±6.8*1 0.26±0.16*1威靈仙小劑量組 50%威靈仙水煎液 10 10 15.7±4.2*1 0.30±0.14*1大劑量組 100%威靈仙水煎液 20 10 14.5±2.5*1 0.25±0.09*1棉團(tuán)鐵線蓮小劑量組 50%棉團(tuán)鐵線蓮水煎液 10 10 22.1±8.6*1 0.33±0.13*1大劑量組 100%棉團(tuán)鐵線蓮水煎液 20 10 15.1±3.2*1 0.25±0.13*1陽性對照組 地塞米松 0.040 10 11.4±3.3*1 0.11±0.03*1空白對照組 0.9%氯化鈉溶液 …10 32.3±6.5 0.47±0.07

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中對抗原最先產(chǎn)生反應(yīng)的細(xì)胞之一，在對抗原的攝取、處理、傳遞以及免疫的啟動和調(diào)節(jié)控制方面都起重要作用。

把定量的印度墨汁靜脈注入小鼠血液循環(huán)后，迅速被單核巨噬細(xì)胞所清除，主要被定居在肝和脾臟的巨噬細(xì)胞所吞噬。在一定范圍內(nèi)，顆粒的清除速率與顆粒劑量呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系，即吞噬速度與血中顆粒濃度呈正比，而與已吞噬的顆粒量成反比。如以不同時間測得的血中顆粒濃度之對數(shù)值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)作圖，則兩者呈直線關(guān)系。此直線斜率即為K，因動物肝、脾重量可影響K值，故再可計算校正的α值。通過K值和α值即可反映出藥物對單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。

根據(jù)本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為:粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮都能降低碳粒K值和α值，降低腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，并且三種藥相應(yīng)劑量組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示三種藥具有相似的降低小鼠單核巨噬細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，抑制機(jī)體非特異性免疫的作用。

根據(jù)藥效學(xué)研究結(jié)果，筆者認(rèn)為:粘魚須與威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮有相似的鎮(zhèn)痛、抗炎、細(xì)胞免疫和非特異性免疫抑制作用，故粘魚須可以作為祛風(fēng)濕藥威靈仙使用;至于粘魚須免疫抑制作用的有效成分為何物，以及粘魚須與毛茛科鐵線蓮屬植物威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮的藥動學(xué)和臨床療效有何差異，則有待于進(jìn)一步的藥理研究和臨床觀察。

［1］ 全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1975:614-615.

［2］ 李家實(shí)，肖培根，樓之岑.中藥威靈仙的原植物和生藥學(xué)研究［J］. 藥學(xué)學(xué)報，1980，15(5):288-297.

［3］ 謝宗萬.中藥品種理論研究［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，1991:49-59.

［4］ 謝宗萬.中藥材品種論述(上冊)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1964:95-96.

［5］ 石強(qiáng).粘魚須、威靈仙、棉團(tuán)鐵線蓮對細(xì)胞免疫與體液免疫的影響比較［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，30(2):163-166.

［6］ 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:68-69.

［7］ 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.2版.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006:722-724.