細胞永生化技術在體育領域研究的可行性分析

劉 宇，趙玉華

（哈爾濱體育學院，黑龍江 哈爾濱 150008）

細胞永生化技術在體育領域研究的可行性分析

劉 宇，趙玉華

（哈爾濱體育學院，黑龍江 哈爾濱 150008）

目前細胞生物學技術迅猛發展，使優秀運動員細胞“永生化”成為可能。這在根本上解決了尋找抑制人類運動能力基因研究的接力式進行和標本的暫時性的采集中存在的矛盾，介紹永生化技術在體育研究中的進展，旨為在尋找和提高影響人類運動能力基因方面提供可行性的研究方法。

永生化；細胞；體育

Abstract: Techniques of cell biology have been developing rapidly to date, rendering it possible to immortalize athletic cells. In addition, it radically solves the conflict between the intermittent search of determinant genes of human athletic potentials and the temporariness of sampling. This research introduces the latest progress of cell line immortalization in sports, serving the purpose of finding applicable investigation method of athletics related genes.

Key words: Immortalization; Cell; Athletics

CLC number: G804.21 Document code: A Article ID: 1008-2808(2011)01-0083-04

正常組織來源的體細胞在通常的體外培養條件下可生長和分裂,但經過有限次的細胞傳代后,就會停止增殖,發生衰老和死亡。而生殖細胞、(胚胎)干細胞、部分腫瘤細胞和外源性基因轉染而構建的永生化細胞則具有無限分裂和增殖的能力,是永生化細胞［1］。而能得到越秀運動員的永生化細胞，就為我們研究人類自身限制運動能力基因的連續性，提供了便利的條件。

1 永生細胞的機制

1.1 細胞的衰老

細胞經多次分裂后,在腫瘤抑制因子p53和Rb作用下,細胞對生長因子等失去反應,產生DNA合成蛋白抑制因子,當DNA不能完成修復時，細胞不可逆地停滯于G1期,發生衰老(senescence,M1期)。直到DNA完成修復，阻抑停止，細胞進入S期；如果DNA損傷不能得到有效修復，則p53可能誘導編程性死亡。細胞再經過20～30群體倍增次數(population doublings，PDs)后，進入危機期(crisis,M2期),細胞出現退化,凋亡或者死亡。只有少數細胞在一定因素的影響下，端粒酶被激活，以自身RNA為模板合成端粒DNA來補充或延長端粒，恢復染色體的穩定性，從而使細胞越過危機期，發生了永生化［1-4］。

1.2 細胞永生化

一般認為永生化是體外培養細胞經過自發的或外界因素的影響而從增殖危機中逃逸,從而具有無限增殖能力的過程。基本原理是通過基因轉染技等技術，將外源性的永生相關基因轉入體外培養的目的細胞，或誘導衰老相關基因突變，以增加永生化的發生概率。被普遍接受的永生化機理是M1-M2理論:細胞經多次分裂后,在腫瘤抑制因子p53和Rb作用下,細胞進入M1期,開始衰老,但不一定死亡。而病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等則可以抑制M1期機制,細胞繞過M1期繼續生長。細胞經過20～30次的群體倍增后,進入M2期,細胞出現退化,絕大多數細胞發生凋亡,只有罕見的細胞在一些因素影響下,端粒酶被激活,以它自身RNA為模板不斷合成端粒DNA來補充和延長端粒有限長度,以維持端粒長度,恢復染色體的穩定性使細胞得以逾越M2期,獲得無限分裂和增殖的能力,細胞發生永生化［5］。細胞自發性永生化的幾率非常小,嚙齒類動物細胞為10-5～ 10-6,而人類細胞則更罕見,小于10-12［6］。因此,保存優秀運動員細胞，尋找影響人類運動能力基因就有必要借助細胞永生化技術。學者們通過基因轉染等技術將外源性永生化基因轉入目的細胞內,以增加永生化的發生幾率,進而建立永生化細胞系。

2 細胞永生化技術的應用

細胞永生化技術發展到今天已有了長足的進步，EB病毒、SV40病毒都是永生化細胞常用的轉化病毒，而如乳頭瘤病毒E6、乙型肝炎病毒(HBV) 雖不是使細胞永生的常用病毒,但它們可以使一些特殊細胞的增殖能力加強。

2.1 細胞永生化技術在醫學遺傳領域的應用

楊靜［7］等借助EB病毒和TPA的體外協同作用，采用相差顯微攝影、間接免疫熒光等方法對12例EB病毒感染的原代人胚鼻咽上皮細胞生長過程進行了觀察，針對我國南方地區高發的惡性腫瘤，鼻咽癌，建立了一個良好的體外多階段細胞模型，為能徹底闡明鼻咽癌發病的分子機制打下基礎。潘小平［8］等指出肝組織細胞永生化技術不僅能為肝組織細胞生物學的研究提供性狀穩定的研究對象,還為生物型人工肝、細胞移植等研究提供了一種可靠的潛在細胞源。柯朝陽［9］等應用含有HPV16 DNA的質粒轉染正常人喉上皮細胞,試圖建立永生化人喉上皮細胞系并確證HPV與喉癌的發生有無因果關系。其永生化細胞人喉上皮細胞系的建立為研究人口腔、食管、支氣管、子宮頸等部位腫瘤提供了良好的體外模型。褚嘉祐［10］等承擔中國不同民族基因組的保存與遺傳多樣性研究，中國不同民族永生細胞庫系統地收集了中國42個民族的58個群體的血樣標本，建立了包含3119株永生細胞株庫和6010余例個體的DNA庫，永久性保存，解決中華民族基因組保存問題，供今后永久性研究。在中華民族基因組保存和遺傳多樣性研究的基礎上，涉及疾病，特別是不同群體發病率有較大差異的疾病基因研究將可能得到突破。

2.2 可應用于體育的永生化技術

在眾多轉化體外細胞使其永生化的方法中，我們常以采集樣本方便，病毒轉化永生化細胞率高，操作周期短的EB病毒轉化外周血B淋巴細胞建立永生細胞系［11］，為保存優秀運動員基因，研究影響運動能力基因的最合適方法。

EB病毒是愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr）的簡稱。是在非洲伯基特淋巴瘤中發現的一種皰疹病毒，屬皰疹病毒科。EB病毒具有嗜B淋巴細胞的特性，可以在體外直接感染人類外周血淋巴細胞，刺激多克隆免疫球蛋白分泌。在大多數實驗室,B95-8細胞系已成為EB病毒的主要來源。人類和部分靈長類動物的成熟B淋巴細胞上具有EB病毒的受體，所以為EB病毒感染B淋巴細胞已達到無限生殖提供條件。有關EB病毒轉化B淋巴細胞的機制研究認為,EB病毒首先通過病毒外膜蛋白gp350/220與B淋巴細胞表面補體C3d的受體CR2（complement receptor type 2,CR2）結合,由于CR2是補體激活調節劑家族中唯一能在成熟的B淋巴細胞上表達的成員，所以表達CR2的B淋巴細胞，EB病毒通過受體介導的細胞內吞作用進入其內部。EB病毒內嵌進入細胞后，形成一個蛋白覆蓋的液泡，不需要溶酶體的作用，病毒可自行脫包膜，伺候EB病毒核衣殼體直接與液泡膜融合進入胞質、胞核［12］。進入宿主細胞后，EB病毒脫去衣殼，末端重復序列融合，病毒基因組環化以多拷貝型質粒的形式保存。病毒基因組編碼的EBNALP、1、2、3A、3C和LMP1對維持細胞的轉化是必需的,其中EBNA2、3C和LMP1直接誘導B淋巴細胞在正常活化途徑中所需基因的表達［13-16］。EB病毒永生化的B細胞的一個最顯著的特點就是端粒酶活性的提高,這可能是導致B細胞永生的主要原因。EB病毒轉化外周血B淋巴細胞,使其成為一種能連續分裂永久生存的類淋巴母細胞,由此建立的類淋巴母細胞株即為永生細胞株, 其端粒酶活性提高，維護了細胞染色體端粒長度的穩定，并能夠不斷分裂增殖，從而促使B淋巴細胞的永生性生長，它可永遠的進行傳代,并且每一種永生細胞株保存了原來提供血樣個體的完整基因組,而且它的生化和分子生物學特性不發生變化［17-20］，所以可作為優秀運動員基因庫建立的首選方法。

運用細胞永生化技術建立運動員基因庫鮮有報道，但我國優秀運動員的基因庫建設已開始進行。2006年，由上海市科委資助，上海體育科研所承擔的“上海優秀運動員基因庫的初步建立及身體素質相關基因的研究”課題結題，建立起上海及中國部分重點耐力性項目優秀運動員基因庫［21］。2007年，臺灣體育學院的一個研究團隊建立“運動高手基因庫”，其中包括跆拳道，棒球兩個項目的優秀運動員，用唾液采樣的方式取得杰出運動員的基因，進一步分析其特殊基因模式，并認為日后可作為選才的依據［22］。2008年“國家計劃生育委員會科學技術研究所”里，建立了由中國科學家獨立操作的“中國人遺傳資源庫”，其中共有20個資源類型，已經采集24萬份生物信息樣本。比起“腫瘤”、“人體組織器官”這樣的資源庫，“優秀運動員”的資源庫很小，目前只有血液樣本390份。但這個資源庫卻因為已經采集了劉翔、姚明這樣著名的運動員的遺傳信息而備受關注［23］。目前湖南等幾家地方體科所正聯合北京體育大學，籌建優秀舉重運動員基因庫，龍清泉等國際健將都將列入研究對象［24］。

3 細胞永生化技術在體育中的應用前景

EB病毒轉化優秀運動員外周血B淋巴細胞建立的永生細胞株讓原本有一定壽命的人體細胞能夠不間斷地繁殖下去，使各個領域優秀運動員的基因得以永久的保存。永生細胞株的建立不但能夠永久保存相關個體的基因，而且由于可以為研究各運動項群基因結構差別、探討各運動項群的共同點及之間差別、探索重要抑制運動能力基因在各運動項群中分布特征及遺傳學意義、建立一系列與耐力、力量、速度性相關的項群體系細胞庫、基因探針、基因興奮劑等諸多體育科研領域提供源源不斷的細胞和DNA，所以在體育科學研究中建立優秀運動員的永生細胞庫必將得到越來越多的重視。永生細胞株在轉化前后其細胞和分子遺傳學是穩定的，但細胞株在長期傳代的過程中遺傳特征是否發生改變，是一個關系著科學研究中實驗結果準確性的重要問題，也是我們繼續研究的方向［25］。

4 結束語

尋找影響和限制人類運動能力的基因需要長時間的探索與研究。但是，在傳統的方法中，研究的接力式進行和標本的暫時性的采集中存在的矛盾很難調和，所以將優秀運動員的基因進行細胞永生化，可有效的對同一研究對象進行持久的連續性的研究。細胞永生化技術這不僅僅將運動遺傳資源得到有效地保存，也是為進一步影響運動能力基因的尋找與開發提供了物質基礎，更是為青少年兒童的運動選材、優秀運動員及后備人才的選拔提供了現實依據。

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The Feasibility Analysis of Cell Line Immortalization in Athletics

LIU Yu, ZHAO Yu-hua
(Harbin Institute of Physical Education, Harbin 150008, HeilongJiang China)

G804.21

A

1008-2808(2011)01-0083-04

2010-08-29；

2010-09-26

劉 宇（1985－），男，在讀碩士研究生，研究方向為體育運動中競技能力的開發與評定。