自養小球藻培養條件的優化

張正潔， 汪 蘋

(北京工商大學食品學院，北京 100048)

自養小球藻培養條件的優化

張正潔， 汪 蘋

(北京工商大學食品學院，北京 100048)

在無菌條件下，對影響自養小球藻生長的主要因素進行優化.實驗表明，優化結果對小球藻的生長有顯著影響.通過正交試驗和單因素實驗得到了以BG－11培養基為基礎的優化培養條件:Na2CO3質量濃度為0.02 g/L、初始pH值為7、N/P為30、接種量為5%、溫度25℃、光照強度8 800 lx.該優化條件有效地提高了自養小球藻的生長速率.

小球藻;自養培養;培養基

小球藻為綠藻門(ChloropHyta)小球藻屬(Chlorella)的一種單細胞綠藻，其生態分布廣，世界上已知的小球藻現有15種左右，加之其變種可達百種之多［1］.我國常見的種類有普通小球藻(Chlorella vlgaris)、橢圓小球藻(Ch.ellipsoidea)和蛋白核小球藻(Ch.py-renoidosa).小球藻富含蛋白質、不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸、DHA、EPA等)、類胡蘿卜素、蝦青素和多種維生素［2］，具有極高的營養價值和提高免疫力的功效.其中不飽和脂肪酸(PUFA)更具有廣泛的生物學活性，具有抗血栓、降血脂等功能，尤其對心腦血管、關節炎等疾病有良好的防治作用.此外，DHA還能促進腦細胞的生長發育，改善大腦機能［3］.傳統上，深海魚油是不飽和脂肪酸的主要來源，但從魚油中提取的不飽和脂肪酸存在腥臭味，且處理過程復雜.微藻作為水體中初級生產力，具有合成不飽和脂肪酸的能力［4］，且藻體內PUFA的相對含量遠遠高于魚油中的含量，從藻細胞中提取的PUFA產品沒有腥臭味，不含膽固醇成分，避免了服用魚油膠囊時攝入大量膽固醇的缺點.此外，小球藻還含有一種非常重要的成分——小球藻生長因子，它既具有誘發干擾素激發人體防御和免疫組織中的巨噬細胞、T細胞和B細胞的功能，又具有人體對環境污染有害物質解毒和排泄的作用［5］.因此，小球藻被聯合國糧農組織列為21世紀人類健康食品.

小球藻作為光能自養型生物，可利用CO2作為碳源供其生長，雖多數微藻在CO2環境濃度為1% ～5%時生長良好，但現已發現可將微藻馴化為耐受高濃度CO2的藻種［6］，由此對酒精發酵工藝中排出的高純度CO2(每年約500萬噸)吸收利用，既節約了資源，又減少了溫室效應的發生.基于小球藻的上述特點，美國、日本、以色列等國家先后開發出現代化的小球藻培養技術并成為小球藻的主要生產國.目前該領域在我國研究較少，國內開展此項工作，其經濟效益和社會效益前景廣闊［7］.

利用小球藻固定CO2并得到高不飽和脂肪酸等產物，需獲得大量藻體.本研究以普通小球藻為材料，考察溫度、光照強度、接種量、pH值以及營養成分對小球藻生長速率、細胞積累量的影響，尋求最優培養條件，提高小球藻生物量，以期為今后大規模培養小球藻提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種來源

本實驗藻種購自中國科學院水生研究所淡水藻庫無菌普通小球藻1068藻株(Chlorella vlgaris 1068 strain).

1.1.2 培養基配方

本實驗在BG－11培養基的基礎上進行優化，1L BG－11培養基由5種儲備液(1～5)及NaNO3構成.分別取儲備液1:2 mL，2:20 mL，3:2 mL，4:1 mL，5:1 mL及1.5 g NaNO3于容量瓶中定容至1 L，調pH值為7.5.儲備液配方如下:

儲備液1(g/L) 檸檬酸0.3 g，檸檬酸鐵銨0.3 g，Na2-EDTA0.05 g.

儲備液 2(g/L) KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 3.75 g.

儲備液 3(g/L) CaCl2·2H2O 1.8 g.

儲備液4(g/L) NaCO32 g.

儲備液 5(g/L) H3BO32.86 g，MnCl2·4H2O 1.81 g，ZnSO4·7H2O 0.222 g.

NaMoO4·5H2O 0.39 g，CuSO4·5H2O 0.079 g，Co(NO3)2·6H2O 0.049 g.

其中，儲備液1，3，4 定容至100 mL;儲備液2，5定容至1 000 mL.

1.2 實驗方法

1.2.1 生物量的測定

接種后，每日定時于超凈工作臺取樣，以血球計數板法測定小球藻的細胞個數，繪制生長曲線，計算藻體生長速率.計算公式［5］:

式(1)中，K為生長速率，d－1;N0為起始細胞密度，106mL－1;N為經過 t時間的細胞密度，106mL－1;T為平均世代時間，d;t為生長時間，d.

實驗采用25×16型血球計數板，細胞密度:N=(80個小格內細胞個數/80)×400×104×稀釋倍數.

1.2.2 培養條件的確定

100 mL培養液裝于250 mL三角瓶內，121℃滅菌20 min.超靜工作臺接種、取樣，置于25℃光照培養箱中自養培養，光照強度8 800 lx，光暗比為12∶12，每日定時于160 r/min搖床內搖15 min.

1.2.3 正交試驗優化培養基

小球藻生長所需的營養元素有15～20種，大多數元素不會成為限制性因子，其中C、N、P是其生長的主要營養元素［5］，對小球藻的生長及其產物的積累有較大影響.

小球藻利用空氣中的CO2進行光自養生長，CO2主要以HCO－3的形式利用，因此HCO－3鹽可作為小球藻生長的碳源［8］.空氣中CO2體積分數為380×10－6，溶解于水中的 CO2將與空氣中的 CO2分壓產生平衡，符合亨利定律:

式(2)中，x*A為溶質A在液相中的濃度;P為大氣壓強，在本實驗過程中取標準大氣壓值101 325 Pa;kA為亨利系數(Pa);yA為溶質A在氣相中的濃度.

查得 25℃ 下，Ka=1.66×108Pa，yA=0.038%，P=101 325 Pa.

由計算可知，每100 mL的培養基中均有0.056 mg的CO2溶于水中.自養小球藻利用空氣中的CO2供其生長，因此在優化培養基條件時Na2CO3的質量濃度無須過大.

氮、磷是生物生長所需的重要營養成分.一般認為，氮、磷是限制藻類增殖的重要因素，而硝酸鹽和磷酸二氫鉀一直是培養小球藻的一種普通氮源、磷源，一定的氮磷比將促進小球藻細胞的增長.

培養基的pH值是影響藻類生長代謝等許多生理過程的另一重要因子，并影響光合作用中CO2的可用性［9］.小球藻存活的pH值范圍為4.5～10.6，pH值較低，碳源主要以CO2和H2CO3的形式存在，不利于小球藻的利用;pH值較高，小球藻細胞易老化，細胞繁殖受到強烈抑制而導致生長緩慢.因此，接近中性的pH值最有利于小球藻的生長［10］.，

本實驗利用正交試驗優化培養基中的Na2CO3濃度、N/P、pH值，并考慮Na2CO3質量濃度和pH值的交互作用，采用L9(34)正交表(表1)進行3因素3水平正交試驗.

表1 因素水平表Tab.1 Levels of factors

2 結果與討論

2.1 營養鹽濃度和pH值對小球藻生長的影響

根據表1數據，在光照培養箱中光照培養，接種量為10%、溫度25℃，光照強度8 800 lx，光暗比為12∶12，每日定時于160 r/min搖床內搖15 min.培養12 d于超靜工作臺內取樣，血球計數板法測定小球藻的細胞個數并計算細胞密度.實驗與直觀分析結果見表2.

表2 正交試驗與直觀分析結果Tab.2 Results and analysis of orthogonal tests

表2中，第3列設計為ρ(Na2CO3)與pH值的交互作用列.4種因素對小球藻生長的影響按級差R的大小排列為ρ(Na2CO3)＞ρ(Na2CO3)×pH＞N/P ＞pH，ρ(Na2CO3)及 ρ(Na2CO3)與 pH 值的交互作用對小球藻生長的影響最為顯著，pH值和N/P對其生長的影響因素較小，不構成顯著影響.

通過比較 K1、K2、K3可知，當 Na2CO3的質量濃度大于0.05 g/L時，小球藻的生物量明顯下降，而小于0.05 g/L時，隨Na2CO3質量濃度的降低生物量稍有增加，但此趨勢明顯減緩.由此得出優化培養基配方:ρ(Na2CO3):0.02 g/L;pH 值:7;N/P:30.此結果與正交試驗中長勢最好的第2組實驗條件相同，無需驗證.

2.2 正交試驗中的交互作用

小球藻通過光合作用將二氧化碳、水和無機鹽轉化為有機物.二氧化碳主要以HCO－3形式被利用，pH值是影響培養基中HCO－3在總溶解狀態的CO2所占比例的主要因素，因此pH值與ρ(Na2CO3)二者將產生一定的交互作用，這與實驗結果相符.

據表2可知，按級差R的大小排列，ρ(Na2CO3)與pH值的交互作用對小球藻生長的影響僅次于ρ(Na2CO3).對于如此明顯的交互作用在實驗中應給予關注.表3為ρ(Na2CO3)與pH值的交互作用表.

表3 ρ(Na2CO3)與pH值交互作用Tab.3 Interaction of ρ(Na2CO3)and pH 106mL－1

由表3可知，Na2CO3質量濃度為0.02 g/L，pH值為7時小球藻的生長密度最高，長勢最優.

2.3 接種量對小球藻生長的影響

本實驗將9個250 mL三角瓶分為3組，每組接種量分別為5%，10%，15%(V/V)，三角瓶裝液量為100 mL，置于光照培養箱中培養7 d，每日定時于超凈工作臺內取樣，以血球計數板計數，測定結果取平均值，結果見表4，生長曲線如圖1.

表4 不同接種量的測定結果Tab.4 Measured results with different inoculum

提高接種量是縮短延滯期的有效措施之一.一般情況下，接種量越多其延滯期越短，但由于接種量的增加在一定程度上造成了裝液量的增加，從而導致液面與空氣接觸面積減小，影響溶解氧.實驗中10%，15%的接種量無論生長速率，還是細胞的積累量均小于5%的接種量，且隨接種量的增加，生長速率依次減小，細胞積累量依次降低，由此確定接種量以5%為宜.這與潘欣［10］、張麗君［11］得出的 10%為最佳接種量的結論不符.

圖1 接種量對小球藻生長的影響Fig.1 Effects of inoculums on grows of Chlorella.sp

2.4 溫度對小球藻生長的影響

微生物的生長和產物的合成都是在各種酶的催化下進行的，溫度是保證酶活性的重要條件，因此在微生物發酵系統中必須保證穩定而適合的溫度環境條件［11］.

在本實驗中，取9個250 mL三角瓶分為3組，分別置于20，25，30℃下培養.三角瓶裝液量為100 mL，接種量為5%，光照培養箱中培養7 d，每日定時于超凈工作臺內取樣，以血球計數板計數，測定結果取平均值，結果見表5，生長曲線如圖2.比較從20～30℃的3種不同溫度梯度的培養結果，在25℃的條件下，小球藻的細胞積累量及其生長速率均好于20℃和30℃.因此，當溫度為25℃時最適宜自養小球藻的生長.

表5 不同溫度下的測定結果Tab.5 Measured results with different temperature

2.5 光照強度對小球藻生長的影響

小球藻作為光合自養型生物，光是影響其生長的重要限制因素.當溫度和營養元素不限制其生長時，光就成為影響小球藻自養生長的主要因素.

圖2 溫度對小球藻生長的影響Fig.2 Effects of temperature on grows of Chlorella.sp

一般情況下，在一定光照范圍內藻的光合作用效率會隨光照強度的增加而增加，但光照強度達到一定值時，光合作用效率幾乎保持在一定水平不再增加，這種現象稱為光飽和效應.如果光照強度超過光飽和點后，藻的光合效率將會下降，導致細胞生長緩慢甚至死亡，即光抑制限制.在光飽和點以下的光照強度是藻生長的一個限制性因子［12］.

實驗中，光照強度分別取4 400，8 800，13 200 lx進行單因素實驗，結果見表6，生長曲線如圖3.光照強度為8 800 lx時，小球藻長勢最好，其生長速率最快，細胞積累量最大.光合作用由光反應和暗反應兩個過程組成，當暗反應所需的中間產物不能從光反應中得到充分滿足時，整個過程的速率完全取決于光反應的速率，即隨著光照強度的增加光合作用加強，小球藻的生長較快;若光反應形成了大量中間產物，而暗反應速率已配合不上光反應速率，此時光合作用的整體速率將只取決于暗反應的大小，同時由于光照強度太強，會導致光合色素的光氧化和細胞中的某些酶受到氧化傷害而使光合作用速率下降，因而存在一個適宜的光照強度［13］.

表6 不同光照強度下的測定結果Tab.6 Measured results with different illumination

3 結論

小球藻含有大量陸地生物所缺乏且十分獨特的生物活性物質，具有生長快，產量高，可定向培養，適應能力強，易調控等特點，因而是許多高附加值生物制品的重要來源.利用小球藻含有的活性物質已成為目前各國的研究熱點之一，其開發利用前景廣闊，因此研究在培養過程中如何提高小球藻細胞密度及其生長速率具有重要意義.

圖3 光照強度對小球藻生長的影響Fig.3 Effects of illumination on grows of Chlorella.sp

BG－11培養基適用于小球藻的培養，但培養效果不甚理想.為尋求最佳的培養條件，提高生長速率，縮短培養周期，得到大量藻體，本實驗通過3因素3水平正交試驗，以及接種量、溫度、光照強度單因素實驗，得到了以BG－11培養基為基礎的優化培養基配方:Na2CO3質量濃度為0.02 g/L、初始pH值為7、N/P為30、接種量為5%、溫度25℃、光照強度8 800 lx.實驗顯示，經優化培養基培養的小球藻的生長速率為0.381 d－1，細胞積累量達到40.95×106mL－1，而在未經優化培養基條件下，其生長速率為0.107 d－1，細胞積累量為5.5 ×106mL－1.速率提高了3.561倍，細胞積累量提高了7.45倍，說明該優化培養基有效地提高了小球藻的生長速率及細胞積累量，為該藻的高密度大規模培養提供了有力依據.

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(責任編輯:葉紅波)

Optimization of Culture Conditions of Chlorella.sp

ZHANG Zheng-jie，WANG Ping
(School of Food，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

The effects of culture conditions on the growth of Chlorella.sp were studied.The nutrient factors showed obvious effect on Chlorella.sp.The culture conditions based on BG-11 were optimized by orthogonal experiments:Na2CO30.02 g/L，the initial pH 6，the ratio of nitrogen to phosphorus 30，inoculum 5%，temperature 25℃，illumination 8 800 lx.Under the optimal culture conditions，the growth rate of Chlorella.sp was enhanced significantly.

Chlorella.sp;autotrophic culture;medium

TS201.3

A

1671-1513(2011)01-0054-05

2010-09-13

國家“十一五”科技支撐計劃項目(2007BAK36B07).

張正潔，女，碩士研究生，研究方向為小球藻的固碳作用及其產物;

汪 蘋，女，教授，主要從事水污染控制工程、廢水生物處理及反應器方面的研究.通訊作者.