1株桃果實采后病原真菌的鑒定以及碳源代謝指紋圖譜分析

王友升， 郭曉敏， 姚子鵬， 李麗萍

(北京工商大學食品學院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

1株桃果實采后病原真菌的鑒定以及碳源代謝指紋圖譜分析

王友升， 郭曉敏， 姚子鵬， 李麗萍

(北京工商大學食品學院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048)

從采后貯藏過程中發病的八月脆桃果實(Amygdalus persica cv.Bayuecui)中分離到1株真菌菌株074#.通過對病原菌形態學觀察以及核糖體ITS rDNA序列分析，證明菌株074#為灰葡萄孢霉菌(Botrytis elliptica).致病性試驗結果表明，桃果實為灰葡萄孢霉菌的寄主.通過Biolog FF MicroPlate分析該病原菌對95種碳源的利用能力，結果表明，Botrytis elliptica代謝指紋圖譜為最適碳源包括 D-果糖、蔗糖、L-蘋果酸、琥珀酸、D-葡萄糖酸、L-天門冬氨酸、L-絲氨酸、腺苷、5'-磷酸腺苷等26種，可利用碳源14種，不可利用碳源55種.

桃果實;病原真菌;ITS rDNA序列分析;碳源代謝指紋圖譜

桃果實(Prunus persica)為呼吸躍變型果實，采后后熟迅速，極易遭受病原微生物的入侵而發生腐爛［1］.人們對化學農藥殘留潛在威脅的擔憂，促使高效、低毒、低抗性的新型防腐劑的篩選成為國內外研究熱點［2］，而防腐劑快速篩選的前提是準確分離到桃果實的致病菌.雖然已報道引起桃果實病害的病原菌有10余種，且主要是真菌［3］，但對于桃果實采后貯藏期間致病菌的研究較少.ITS rDNA內含有可變區間，可用來解決真菌的分類和進化問題［4－6］.Biolog微生物自動分析系統可檢測特定菌株對該系統提供95種碳源的利用情況，獲得該菌種的碳源代謝指紋圖譜［7］.然而，同時結合分子生物學鑒定與Biolog碳源代謝指紋圖譜分析病原真菌特征的報道也不多.

本研究分離到1株桃果實采后病原真菌，對該真菌采用ITS r DNA序列分析結合形態學進行分類鑒定，并利用Biolog鑒定系統分析其碳源代謝指紋圖譜，以期為桃果實的采后貯藏保鮮過程中病原微生物的控制提供一些參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

菌株分離于采后貯藏過程中自然發病的“八月脆”桃果實.

1.1.2 培養基

1)PDA培養基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，加水補足1 L，121℃滅菌15 min.液體培養基不加瓊脂粉.

2)ME培養基:麥芽浸粉20 g，瓊脂18 g，加入一定量的水中，溶解后用NaOH溶液調節pH值至5.5±0.2，121℃滅菌15 min.

1.1.3 試劑

DNA分子量標準(MarkIII和 MarkVII)、10倍PCR Buffer、dNTP、TaqDNA聚合酶，購自天根生化試劑公司;氯化芐、EDTA、NaC1、Tris、氯仿、異戊醇，國產分析純試劑;通用引物ITS-1和ITS-5由Invitrogen公司合成.

1.1.4 儀器

PCR儀，美國Bio-RAD公司;電泳儀和電泳槽，北京六一儀器廠;HZQ-F全溫振蕩培養箱，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司;高速冷凍離心機，德國SORVALL公司;生物安全柜，美國Thermo公司;Biolog鑒定系統，美國 Biolog公司;顯微鏡，德國Zeiss公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的分離、純化與回接

分離:用鑷子夾取發病桃果實病健交界處到培養基上，于30℃下培養3～5 d.

純化:觀察分離生長出菌落的外觀形態，挑選外觀生長形態不同的絲狀真菌，然后將它們分別轉接到PDA和ME培養基上，每個培養平板上轉接對稱位置的3點位置，于30℃下培養數天，分別選取生長7 d和14 d照相觀察菌落生長情況.待生長情況良好后于顯微鏡下觀察菌絲及分生孢子梗等個體形態特征.

回接:用無菌接種針在桃果實表面刺3個孔，取純化后的絲狀真菌塊接種至傷口處，在30℃下培養數天，觀察果實接種處是否出現病癥.

1.2.2 基因組DNA的提取及ITS區PCR擴增與序列測定

用改良后SDS-氯化芐法提取基因組DNA作為PCR反應的模板［8］.ITS區擴增通用引物為 ITS-1(5'-GTAGTCATGCTTGTCTC-3')和 ITS-5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3').PCR反應體系中含 10倍擴增緩沖液 5 μL;dNTP(每種 2.5 mmol/L)4 μL;引物(10 μmol/L)各 2 μL;Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL;無菌超純水補足總體積至50 μL.ITS區擴增反應程序為:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min.72℃延伸l min，30個循環，72℃延伸10 min.反應結束后取5 μL PCR產物加1 μL 6倍溴酚藍上樣緩沖液，在1.5%瓊脂糖凝膠上120 V電泳40 min進行檢測，EB染色后于紫外燈下觀察電泳條帶.

1.2.3 序列比對和系統發育樹的構建

PCR產物經脫鹽純化后，由天根生化科技(北京)有限公司進行測序.測序結果在GenBank數據庫中進行同源序列搜索(BLAST)，比較供試菌株與已知霉菌相應序列的同源性.為進一步顯示實驗菌株與已知菌株的親緣關系及其分類地位，根據同源序列搜索結果，提取相關模式菌株的ITS區基因序列，與實驗菌株序列一起用Clustal X軟件進行匹配排列(align)，用MEGA3.1軟件選用參數P-距離(pdistance)和成對刪除(pairwise deletion)法，將序列資料轉換成距離后以neighbor-joining分析法構建系統發育樹，并通過Bootstraps進行1 000次漸啟式復制以檢驗進化樹枝的置信度.

1.2.4 碳源代謝指紋圖譜的獲得

將桃病原菌菌株在PDA培養基平板上30℃培養120 h，用FF—IF濁度標準液配制成均一的菌懸液，調節T=75±2%.在FF微孔板中每孔加100 μL 菌懸液，于30 ℃ 培養，24，48，72，96 h 后分別用Biolog微生物鑒定系統讀取結果，獲得病原菌對95種碳源的代謝指紋圖譜.

2 結果與分析

2.1 菌株的分離、純化與回接結果

桃果實病健交界處的組織在PDA培養基中30℃培養5 d后，得到1株致密絨毛狀、無褶皺、灰褐色的絲狀真菌(圖1(a))，命名為074#.將074#在PDA平板上純化后回接到桃果實上，在接種部位出現同樣的病癥(圖1(b))，并能從該病害部位再次分離得到074#.因此，確定絲狀真菌074#為桃果實的病原真菌.

圖1 絲狀真菌074#的分離(a)與回接(b)Fig.1 Separation(a)and re-inoculation(b)of fungal 074#of peach fruit

2.2 形態觀察與分析

菌落形態觀察結果表明，074#菌株在PDA和ME培養基上30℃培養均生長旺盛，菌落均勻圓形，邊緣光滑細致，菌絲滲透在培養基表面淺層，色素產生較少，比較而言，在ME培養基上培養7 d后菌落直徑較大(圖2(a)、(d)).繼續培養至14 d時，菌落向培養基周圍的均勻伸展，其中在ME培養基上生長情況較好，后期菌落整體呈現淺黃色，菌絲較短(圖2(b)、(e)).

個體形態觀察結果表明，074#菌株的菌絲著色較淺，分枝多且內部隔膜觀察明顯，具有3個或多個隔膜，菌絲頂端有分支，有少量的菌絲滲出液，菌絲小枝對生.分子孢子呈現橢球形，孢子壁光滑，孢子梗淺褐色.菌絲初為白色，后變為黑褐色.分生孢子梗直立，有3～5個分枝，有1～3個隔膜，其頂端簇生葡萄狀分生孢子.分生孢子無色至淡褐色，卵圓形或球形，單胞，大小16～32×15～24 μm，頂端具尖突.菌絲生長后期形成菌核.菌核黑色，球形或不規則形，大小0.5～1.4 mm(圖2(c)、(f)).

圖2 074#菌株在PDA和ME培養基上30℃培養7 d和14 d的菌落特征以及菌絲顯微形態Fig.2 Colony characteristics and microscopic shape of No.074 strain cultured 7 d and 14 d at 30 ℃ on PDA and ME medium

2.3 基因組DNA的提取和PCR擴增

采用SDS-氯化芐法提取的074#菌株總DNA經瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測后，可以看出所提取的DNA(圖3(a))條帶清晰，表明提取質量較好.以ITS1和ITS5為引物，經PCR擴增得到的產物的電泳條帶特異性強，大小約600 bp(圖3(b))，與實驗設計吻合.

圖3 菌株074#總DNA提取和ITS區r DNA電泳檢測圖譜Fig.3 Electrophoretogram of total DNA and PCR product of ITS rDNA of No.074 strain

2.4 ITS區r DNA同源性比對與系統發育分析

將分離得到的菌株074#的ITS區r DNA基因部分序列與GenBank內登錄的相應序列進行比對，構建鑒定菌株與已知菌株的ITS區r DNA序列進行同源性比對，并且構建系統發育進化樹(圖4).同源性比對結果表明，074#菌株與Botryotinia fuckeliana，Botrytis elliptica，Botrytis sp. 和 Sclerotinia sclerotiorum的同源性均在98.0%以上.同時，結合所構建的系統進化樹結果，可以看出074#菌株與Botrytis elliptica EU519207在同一分枝上，且通過Bootstraps的驗證表明它們具有較高的置信度，支持率可達99%.因此，結合形態特征(圖2)以及與《真菌鑒定手冊》中的灰葡萄孢(Botrytis elliptica)描述進行比較發現結果基本一致，因此可將本研究分離到的074#菌株確定為灰葡萄孢(Botrytis elliptica)［9－10］.

圖4 以ITS rDNA基因序列為分子標記的真菌系統進化樹分析結果Fig.4 Analysis of fungal phylogenetic tree based on ITS rDNA sequence

2.5 碳源代謝指紋圖譜分析

074#病原菌對95種碳源的代謝指紋圖譜，見表1.

表1 病原菌074#以及3種同屬菌株對95種碳源的代謝指紋圖譜Tab.1 Carbon source metabolism analysis of fungal 074#and other three Botryis sp.strains

丙三醇 ++ + + －肝糖 － + ++ +m-肌醇 － － － －2-酮-D-葡糖酸 ++ + + +α-D-乳糖 － + + －乳果糖 － + + +麥芽糖醇 + + + －麥芽糖 － ++ ++ +麥芽三糖 － ++ + +D-甘露醇 － + + －D-甘露糖 － ++ ++ ++D-松三糖 ++ + ++ －D-蜜二糖 ++ + ++ +α-甲基-D-半乳糖苷 － － － －β-甲基-D-半乳糖苷 + + + +α-甲基-D-葡萄糖苷 ++ － － －β-甲基-D-葡萄糖苷 ++ ++ ++ ++異麥芽酮糖 － + + +D-阿洛酮糖 － + ++ +D-蜜三糖 － ++ ++ ++L-鼠李糖 － + + －D-核糖 － + + －水楊苷 + + + －景天庚醛聚糖 － － + －D-山梨醇 ++ + + －L-山梨糖 － + + +水蘇糖 － ++ ++ ++蔗糖 ++ ++ ++ ++D-塔格糖 － + + －D-海藻糖 － ++ + +松二糖 ++ ++ ++ ++木糖醇 － + + －D-木糖 － + + ++γ-氨基丁酸 － + － －溴代丁二酸 － + + －反丁烯二酸 ++ + + －β-羥丁酸 － + + －γ-羥丁酸 － － － －p-羥基苯乙酸 － + + －

注:++表示為最適碳源，+表示可利用碳源，－表示不可利用碳源.

表1顯示了在30℃培養48 h后，074#病原菌可以利用的最佳碳源有熊果苷、β-環式糊精、糊精、D-果糖、D-葡萄糖酸、α-D-葡萄糖-1-磷酸、丙三醇、2-酮-D-葡糖酸、D-松三糖、D-蜜二糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、β-甲基-D-葡萄糖苷、D-山梨醇、蔗糖、松二糖、反丁烯二酸、L-蘋果酸、琥珀酸、琥珀酸單甲酯、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-鳥氨酸、L-絲氨酸、腺苷、5'-磷酸腺苷等26種，而可利用碳源種類僅為N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-阿拉伯糖醇、L-海藻糖、葡糖醛酰胺等14種.相比而言，吐溫 80、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、戊五醇、苦杏仁苷、D-阿拉伯糖等55種碳源均不能被074#病原菌利用.而Biolog數據庫中Botryis屬的3種菌株蔥腐葡萄孢(Botryis aclada)、番茄灰霉病菌Pers.BGA(Botryis cinerea Pers.BGA)、番茄灰霉病菌Pers.BGB(Botryis cinerea Pers.BGB)最適碳源分別為13種、19種、14種，均小于074#病原菌的最佳碳源范圍.

3 討論

已報道桃果實采后常見的致病菌主要有果生鏈核盤菌(Monilinia fructicola)、核果鏈核盤菌(Monilinia laxa)、嗜果枝孢菌(Cladosporium carpophilum)、黃單胞菌(Xanthom onascampestris)、桃炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、葡枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)、擴展青霉(Penicillium expansum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、梨形毛霉(Mucor piriformis)，以及鏈格孢屬 (Alternaria sp.)、小穴殼屬(Dothiorella sp.)、曲霉屬(Aspergillus sp.)和見擬莖點屬(Phomopsis sp.)的某些真菌［11－14］.本研究從采后貯藏過程的發病桃果實上分離得到一株病原菌，并采用ITS區r DNA序列系統發育法、形態特征比對法相結合將其鑒定為灰葡萄孢(Botrytis elliptica).研究表明，灰葡萄孢菌為百合主要致病菌［15］，另外也可侵染豌豆、郁金香、劍蘭等植物［16］.然而，在采后貯藏期間的桃果實上目前未見有相關報道.

Biolog系統可測定微生物對不同單一碳源利用能力，代謝特征指紋是微生物菌種鑒定的依據，也可用于鑒別和區分不同來源的微生物群落［17］.本研究發現，3株同屬真菌與Botrytis elliptica病原菌共有的最適碳源僅有糊精、D-果糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、蔗糖、松二糖等5種，暗示糊精、D-果糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、蔗糖、松二糖可能是該屬真菌的最佳碳源.但Botrytis elliptica碳源代謝指紋圖譜與同屬的3個菌株之間均存在顯著差異，而相同種不同菌株之間的碳源利用情況也不盡一致，這表明Biolog微生物檢測系統可用于種間及種內的差異性分析.

真菌致病過程可分為侵染機構的形成，侵入寄主，定繁和擴展三個階段，而第三階段的順利進行與寄主所提供的營養條件密不可分［18］.桃果實中糖主要有蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨糖醇，酸包括蘋果酸、檸檬酸和奎寧酸［19－20］，而本研究的結果表明，蔗糖、果糖、L-蘋果酸均為灰葡萄孢最適碳源.另外，從Biolog系統的數據庫中也可以看出，番茄灰霉病菌(Botryis cinerea)、桃炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、葡枝根霉菌(Rhizopus stolonifer)、擴展青霉(Penicillium expansum)的最佳碳源均包括蔗糖和果糖，推測桃果實的糖酸成分很適宜灰葡萄孢的菌絲生長.然而，真菌致病性強弱還受所產生的角質酶、真菌毒素以及對植物產生防衛性物質的解毒能力的影響［21］，因此灰葡萄孢對桃果實的致病機理還需進一步研究.

4 結論

1)從采后貯藏自然發病的桃果實上分離得到1株病原菌，經分子生物學結合形態學鑒定為灰葡萄孢(Botrytis elliptica);

2)通過Biolog分析系統，獲得 Botrytis elliptica對95種碳源的代謝圖譜，其中蔗糖、果糖、L-蘋果酸、熊果苷、β-環式糊精、糊精、D-果糖、D-葡萄糖酸等26種為其最適碳源.

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(責任編輯:葉紅波)

Identification and Carbon Metabolic Fingerprinting Analysis of a Pathogen Isolated from Postharvest Peach Fruit

WANG You-sheng， GUO Xiao-min， YAO Zi-peng， LI Li-ping
(School of Food/Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

A fungal pathogen，strain 074#，was isolated from infected peach fruit during postharvest storage periods.Morphological characterization and ITS rDNA analysis confirmed that the strain 074#was Botrytis elliptica.The pathogenicity tests confirmed that Amygdalus persica is a natural host of Botrytis elliptica.The Biolog Microbial Identification System with FF MicroPlate was applied for carbon source utilization test of Botrytis elliptica based on their abilities to utilize 95 discrete substrates.And the result showed that the carbon metabolic fingerprinting of isolated strain was composed of 26 optimal carbon sources，including D-fructose，sucrose，L-malic acid，succinic acid，D-gluconic acid，L-aspartic acid，L-serine，adenosine，denosine-5'-monophosphate，as well as 14 available carbon sources and 55 unavailable carbon sources.

peach fruit;fungal pathogen;ITS rDNA sequence analysis;carbon metabolic fingerprinting

TS205;TS201.3

A

1671-1513(2011)01-0047-07

2010-12-13

北京市科技新星項目(2007B011).

王友升，男，副教授，博士，主要從事食品生物技術方面的研究.