微生物發酵法合成高分子聚合物γ－PGA的研究

梁金鐘， 王風青

(哈爾濱商業大學食品工程學院/黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076)

微生物發酵法合成高分子聚合物γ－PGA的研究

梁金鐘， 王風青

(哈爾濱商業大學食品工程學院/黑龍江省普通高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076)

以一株γ－聚谷氨酸高產菌枯草芽孢桿菌B－115為實驗菌株，分別考察碳源、氮源種類及濃度、前體物添加量、生長因子和發酵條件對γ－聚谷氨酸產率的影響.優化結果顯示:碳源是6.5%的玉米糖化液，氮源是0.4%的普通蛋白胨，前體物谷氨酸鈉的添加量為4%，生長因子種類及添加量分別為0.15%硫酸鎂、0.006%硫酸錳、0.8%磷酸二氫鉀、1.0%氯化鈉、0.03%氯化鈣;發酵條件為初始pH值6.5，接種量2%，裝液量50 mL/250 mL，150 r/min，37℃培養84 h;γ－聚谷氨酸的產率可從57.85 g/L提高到68.30 g/L.

γ－聚谷氨酸;培養基;培養條件;高分子聚合物

γ－聚谷氨酸［poly γ-glutamic acid，γ-PGA］是由微生物代謝合成并分泌到細胞外的一種水溶性高分子物質，這種陰離子物質是由L－谷氨酸和D－谷氨酸單體之間通過酰胺鍵結合而成的同聚酰胺［1］.γ－PGA具有增稠、乳化、保濕、絮凝、粘合，極佳的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性和可降解性等獨特的理化和生物學特性，因此可廣泛應用于食品、化妝品、生物醫學、環境保護等領域［2］，例如:藥物緩釋劑［3］、沙地的保水劑［4－5］、高吸水劑［6－7］、食品用水凝膠［8］、粘稠劑［9］以及高強纖維等［10］，特別是近年來隨著對γ－PGA的深入研究，γ－PGA作為一種高分子生物制品，愈來愈顯現出廣闊的研究價值和應用前景.

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B－115(哈爾濱商業大學發酵工程實驗室保藏).

1.2 培養基及培養條件

1.2.1 斜面培養基

蛋白胨10 g/L，牛肉膏 3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.2～7.4.將現有斜面菌種活化，37℃培養24 h.

1.2.2 種子培養基

斜面培養基加2%葡萄糖，不加瓊脂.種子培養:250 mL三角瓶裝液量50 mL，溫度37℃，轉速150 r/min，置于搖床上培養18 h.

1.2.3 基礎發酵培養基

還原糖 5.655%(玉米糖化液)，谷氨酸鈉5.800%，蛋白胨0.500%，KH2PO40.400%，MgSO40.125%，NaCl1.200%，MnSO40.008%，CaCl20.042%.搖瓶培養:接種量2%，250 mL三角瓶裝液量為50 mL，轉速150 r/min，溫度37℃，培養48 h.

1.3 玉米糖化液的制備

300 g市售玉米粉加水1 000 mL，加入1.05 g無水CaCl2煮沸，調節pH值為6.7～7.0，再加入α－耐高溫淀粉酶(120 U/g原料)，迅速降溫80～85℃，保溫15～20 min，繼續降溫至58～60℃，調節pH值為4.5，加糖化酶(150 U/g原料)，60℃保溫4 h后，再加熱煮沸10 min，過濾除渣，測定糖化液還原糖濃度，低溫保存備用.

1.4 分析方法

1.4.1 γ－PGA產率的測定

將發酵液稀釋后(發酵液∶水=1∶1)于9 000 r/min離心15 min除去菌體，取上清液10 mL，加入25 mL的無水乙醇，劇烈搖晃得到團狀物，將其轉入稱量瓶，置于電熱恒溫鼓風干燥箱中105～110℃下烘2～2.5 h，得到黃色塊狀粗樣品，并稱重.

1.4.2 pH值的測定

PHS－3C型pH計.

1.4.3 粘度的測定

采用DNJ－5S型數字式粘度計，25℃時二號轉子測定.

1.4.4 還原糖的測定

直接滴定法［11］.

1.4.5 谷氨酸及葡萄糖的測定

采用SBA－40D型生物傳感分析儀(山東省科學院生物研究所)測定.

2 結果與討論

2.1 培養基優化

2.1.1 碳源及其濃度對γ－PGA產率的影響

圖1為碳源種類和濃度對γ－PGA產率的影響結果.分別以1%的蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、玉米糖化液、糊精、檸檬糖為碳源，在培養基的其他組分固定情況下進行單因素實驗，結果如圖1(a).由圖1(a)可知，碳源中以玉米糖化液的發酵效果最好，產率最高.玉米糖化液中除了葡萄糖，還有木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、乙酸及少量糠醛等物質，它優于其它單一的碳源，可能就是因為它除了含有菌種生長所必需的碳源外還有其他微量元素和生長因子，其有利于菌種生長或對聚谷氨酸合成酶的活性有所提高.

圖1 碳源種類和濃度對γ－PGA產率的影響Fig.1 Effect of carbon source on γ-PGA synthesis

以玉米糖化液為碳源發酵，如圖1(b)，由圖1(b)可知，玉米糖化液濃度為6.5%時γ－PGA的產率最高.

2.1.2 氮源及其濃度對γ－PGA產率的影響

氮源對微生物的生長和目標產物的積累有重要的影響，因此合適的氮源對于γ－PGA的發酵生產具有重要作用.分別選取硫酸銨、氯化銨、酵母粉、牛肉粉及各種蛋白胨作為氮源，在其他條件不變情況下進行單因素實驗，結果如圖2.由圖2可知，以蛋白胨作為氮源發酵效果最好，產率最高，說明本菌種能很好地利用有機氮源蛋白胨作為優化氮源.

以普通蛋白胨為氮源，選擇不同濃度的普通蛋白胨進行發酵，結果如圖3.由圖3可知，當普通蛋白胨濃度為0.4%時產率最高，而且過多的氮源不利于聚谷氨酸的合成.此外，當普通蛋白胨濃度為0時，也有產物合成，說明普通蛋白胨不是發酵過程中唯一所需的氮源，綜合考慮，選擇氮源的添加量是0.4%的普通蛋白胨.

圖2 氮源對γ－PGA產率的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on γ-PGA syntheis

圖3 普通蛋白胨濃度對γ－PGA產率的影響Fig.3 Effect of concentration of nitrogen source on γ-PGA synthesis

2.1.3 前體物對γ－PGA產率的影響

其他條件不變的情況下，令谷氨酸鈉濃度為:0%，2%，4%，6%，8%，10%，結果如圖4.由圖4可知，當谷氨酸鈉濃度為4%時發酵液黏度最大，當不添加前體物時沒有聚谷氨酸形成，說明谷氨酸鈉是此菌發酵合成聚谷氨酸的必須物質.隨著谷氨酸鈉濃度的增大，粘度有所降低，但產率隨之上升，說明過多的前體物使γ－PGA的分子量有所下降，要取得的高分子γ－PGA同時又比較經濟，選擇添加4%的前體物.

圖4 前體物濃度對發酵效果的影響Fig.4 Effect of concentration of sodium glutamate on γ-PGA synthesis

2.1.4 鎂離子對γ－PGA產率的影響

鎂離子能促進碳源的分解，加速菌體能量代謝，有助于細胞有氧氧化，且適量的鎂離子有助于減少發酵后期產生的乳酸;同時鎂離子又是鈣離子和鉀離子進出細胞所必須的，又是許多重要酶的激活劑［12］.

其他條件不變的情況下，改變MgSO4濃度，結果如圖5.由圖5可知，硫酸鎂濃度為0.15%時γ－PGA產率最大，其濃度小于或大于0.15%時，γ－PGA產率都有所下降，前者可能是由于鎂離子對γ－PGA合成酶激活不充分而使產率較低，后者則可能是高濃度的鎂離子對γ－PGA合成酶起到一定程度的抑制作用致使產率下降，因此選擇0.15%為硫酸鎂的優化添加濃度.

圖5 鎂離子濃度對γ－PGA產率的影響Fig.5 Effect of concentration of Mg2+on γ-PGA synthesis

2.1.5 鈉離子對γ－PGA產率的影響

其他條件不變的情況下，改變NaCl濃度，結果如圖6.由圖6可知，當氯化鈉濃度為1.0%時產率最大，隨著濃度的繼續增大或降低，產率都有不同幅度的降低，考慮到實際生產的費用問題，因此選擇1.0%的氯化鈉為培養基的優化添加量.

圖6 鈉離子濃度對γ－PGA產率的影響Fig.6 Effect of concentration of Na+on γ-PGA synthesis

2.1.6 錳離子對γ－PGA產率的影響

微生物細胞內的許多酶反應中，二價錳離子都是激活劑，其激活作用可部分的替代鎂離子，錳離子和鎂離子共同促進激活酶的反應，以彌補鎂離子的不足［13］.錳離子的濃度還控制著γ－PGA內L－型谷氨酸和D－型谷氨酸的比例.錳離子濃度對γ－PGA產率的影響結果見圖7.由圖7可知，當錳離子濃度為0.006%時，γ－PGA的產率最高，因此以0.006%的錳為優選濃度.

2.1.7 鈣離子對γ－PGA產率的影響

Ca2+存在于細胞中控制細胞的生理狀態，調節質膜的通透性，維持細胞體內的滲透壓.Ca2+也是一些酶的激活劑和部分酶系構成的必要因子，并對一些陽離子的毒性有拮抗作用［14］.Ca2+對聚谷氨酸產率的影響如圖8.由圖8可知，Ca2+濃度為0.03%時γ－PGA的產率最高.

圖7 錳離子濃度對γ－PGA產率的影響Fig.7 Effect of concentration of Mn2+on γ-PGA synthesis

圖8 鈣離子濃度對γ－PGA產率的影響Fig.8 Effect of concentration of Ca2+on γ-PGA synthesis

2.1.8 鉀離子對γ－PGA產率的影響

鉀離子濃度對γ－PGA產率的影響結果見圖9.由圖9可知，γ－PGA的產率隨著鉀離子濃度的上升而上升，但發酵液的粘度在鉀離子的濃度為0.8%時達到最大，隨著濃度的增加產量繼續上升，但是黏度有所下降，可能是高濃度的磷酸鹽抑制了聚谷氨酸合成酶的活性，影響了產物的聚合度，即表現為粘度下降，因此選擇磷酸鹽濃度為0.8%.

圖9 鉀離子濃度對γ－PGA產率的影響Fig.9 Effect of concentration of K+on γ-PGA synthesis

2.2 培養條件優化

2.2.1 初始pH值對γ－PGA產率的影響

考察初始 pH 值為 5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5時發酵產γ－PGA的情況，結果如圖10.培養基的PH值不同，將影響營養物質的離子化程度，繼而影響微生物細胞的運輸機制，促進或妨礙一些營養物質的吸收;另外，pH值過高或過低常常影響微生物細胞中諸多與代謝有關的酶的活性，進一步對微生物的生長和物質代謝產生較大的影響.由圖10可知，當發酵培養基的初始pH值為6.5時，γ－PGA的產率最高，因此在發酵前調pH值到6.5有利于產物的合成.

圖10 初始pH對γ－PGA產率的影響Fig.10 Effect of initial pH on γ-PGA synthesis

2.2.2 接種量對γ－PGA合成的影響

培養了16～24 h的種子液，分別以1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%的接種量接于發酵培養基中，在發酵48 h后檢測γ－PGA的產量，結果如圖11所示:當接種量為2%時，產量最高，隨著接種量的增加，產率隨之下降.不同接種量意味著不同的初始菌體濃度，它影響發酵結束的時間和γ－PGA的產量，它的大小影響細胞生長遲滯期的長短以及細胞倍增繁殖的速度.對發酵生產γ－PGA的過程來說，菌體只有在一定濃度范圍內才能使γ－PGA維持比較滿意的產量，太低或太高的菌體濃度都不利于γ－PGA產量的提高.因此優化接種量可認定為2%.

圖11 接種量對γ－PGA產率的影響Fig.11 Effect of inoculation amount on γ-PGA synthesis

2.2.3 溫度對γ－PGA合成的影響

培養溫度直接影響菌體的生長速率和代謝途徑，以及菌種內合成聚合物的酶活性，從而影響產物的合成.在轉速為150 r/min，發酵時間為48 h，裝液量50 mL的條件下，通過控制不同的培養溫度:31，33，35，37，39 ℃，γ－PGA 的產量隨溫度的變化如圖12所示:γ－PGA產率在37℃最大.

圖12 溫度對發酵效果的影響Fig.12 Effect of temperature on γ-PGA synthesis

2.2.4 溶氧對γ－PGA合成的影響

溶氧在好氧微生物發酵過程中是一個重要因素，產γ－PGA的枯草芽孢桿菌是好氧菌，而在γ－PGA這種高黏度發酵體系中尤為突出.聚谷氨酸在發酵的初始階段，體系的黏度很低，表現為低黏度牛頓體系，隨著聚合物的不斷積累，發酵體系的黏度不斷增加，特別在發酵后期，發酵體系成為高黏度非牛頓體系，影響了氧的傳遞和料液的氧密度，從而影響了菌體產γ－PGA的量.分別以搖瓶裝液量和搖床轉速來考察溶氧對枯草芽孢桿菌發酵產γ－PGA的影響.用 250 mL的三角瓶，分別以 30，50，70，90，110 mL的裝液量進行發酵，結果如圖13所示:當裝液量為50 mL/250 mL時發酵產率最高.

圖13 裝液量對γ－PGA產率的影響Fig.13 Effect of volume on γ-PGA synthesis

再以 50 mL 的裝液量，以 100，150，200，250 r/min的不同轉速進行發酵，結果如圖14所示:當轉速在150 r/min較好，因其他轉速下發酵產率相對較低，但其發酵液粘度最高且提取產物彈性較好，在較低耗能下獲得較高分子量產物，因此綜合考慮選150 r/min為佳.

2.2.5 時間對γ－PGA合成的影響

γ－PGA是非生長偶聯型產物，并不隨菌體量同步增加，而是在細胞進入穩定期后聚合物才大量合成.圖15為發酵時間對γ－PGA產率影響結果.由圖15可知，隨著發酵時間的增加，γ－PGA的產量也隨之增加，特別是當發酵時間由84 h延長到96 h時，其產量也增加很多，但同時發酵液的顏色也加深很多，可能是菌體自溶產生某些物質造成的，這樣不利于γ－PGA的提取純化，經綜合考慮，發酵時間以選取84 h為宜.

圖14 轉速對γ－PGA產率的影響Fig.14 Effect of rotational speed on γ-PGA synthesis

圖15 發酵時間對γ－PGA產率的影響Fig.15 Effect of fermentation time on γ-PGA synthesis

2.3 優化前后發酵規律曲線

圖16為優化前后γ－PGA產率對比結果.由圖16可知，優化后γ－PGA的產率可高達68.30 g/L，比優化前提高了10.45 g/L.

圖16 優化前后γ－PGA代謝合成曲線Fig.16 Metabolism synthesis curve of γ-PGA optimize and optimized

3 結論

通過實驗，確定了枯草芽孢桿菌發酵合成γ－PGA的優化培養基組成及培養條件:6.5%玉米糖化液、0.4%的普通蛋白胨、4%的前體物谷氨酸鈉、0.15%的硫酸鎂、0.006%硫酸錳、0.8%的磷酸二氫鉀、1.0%的氯化鈉、0.03%氯化鈣、初始pH值6.5、接種量2%、裝液量50 mL/250 mL、150 r/min、37 ℃培養84 h;優化后γ－PGA的產率從57.85 g/L升高到68.30 g/L.

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(責任編輯:葉紅波)

Biosynthesis of Macromolecular Polymers γ-PGA by Fermentation

LIANG Jin-zhong，WANG Feng-qing
(School of Food Engineering/Key Laboratory of Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，150076，China)

The fermentation media and culture conditions of Bacillus subtilis B-115 were optimized for producing poly γ-glutamic acid.The optimal fermentation conditions for poly γ-glutamic acid production were as follows:corn saccharification liquid 6.5%，peptone 0.4%，L-glutamate 4%，MgSO40.15%，MnSO40.006%，KH2PO40.8%，CaCl20.003%，NaCl 1%，inoculums level 2%，flask content 50 mL/250 mL，pH 6.5，temperatuer 37 ℃，rotation speed 150r·min－1，and fermentation time 84 h.Under the optimal conditions，the yield of γ-PGA was increased from 57.85 g/L to 68.3 g/L.

poly-γ-glutamic acid;media;culture conditions;macromolecular polymers

TS201.3

A

1671-1513(2011)01-0024-06

2010-09-23

黑龍江省“十一五”重大科技攻關項目(GA06B401－2).

梁金鐘，男，教授，主要從事微生物發酵方面的研究.