高速逆流色譜對大黃蒽醌類成分的分離研究

袁 萍，周東斌，林順權，高俊飛，何 瀏，袁 曉*

1中國科學院武漢植物園，武漢430074;2牌牌科技有限公司，廣州510540

高速逆流色譜對大黃蒽醌類成分的分離研究

袁 萍1，周東斌2，林順權1，高俊飛1，何 瀏1，袁 曉1*

1中國科學院武漢植物園，武漢430074;2牌牌科技有限公司，廣州510540

利用高速逆流色譜對大黃中的5個蒽醌活性成分進行了分離，當兩相溶劑系統的組成是石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=8∶2∶8∶1時，分離出大黃素;當兩相溶劑比為3∶4∶3∶2時，分離出大黃酸和蘆薈大黃素;當溶劑比為12∶2∶12∶1時，分離出大黃酚和大黃素甲醚;經高壓液相色譜檢測大黃素、大黃酸和蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量分別為98.81%、99.15%、98.51%、98.89%和98.16%。

高速逆流色譜;蘆薈大黃素;大黃酸;大黃素;大黃酚;大黃素甲醚;分離

大黃為蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatum L.)、藥用大黃(R.officinale Baill.)或唐古特大黃(R.tanguticum Maxim.ex Balf.)的根及根莖，是我國重要的傳統中藥之一，具有抗菌、抗病毒、消炎止血及降血脂等多種功效，在臨床上有重要作用。大黃也是我國重要的出口藥材，現在世界上許多國家將大黃收錄在藥典中，可以說大黃已經成為世界性的藥物，各國的科學工作者對大黃所含的化學物質進行了許多深入研究，以求建立起簡便快速分離大黃品種優劣的方法。目前從大黃屬分離出成分160多種，主要包括蒽醌類、蒽酚酮及其酯衍生物、雙蒽酮類等。大黃藥用成分主要為大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚以及它們與糖苷生成的結合型蒽醌［3］.

1 材料和方法

1.1 材料

HPD-100大孔吸附樹酯由滄州寶恩吸附材料科技有限公司提供，大黃(Rheum palmatum L)干燥根莖由湖北省中藥材公司提供。

1.2 儀器與藥品

OptichromeTM-A半制備J型螺旋管行星式高速逆流色譜儀;江陰逆流科技有限公司生產;檢測器為UV3000紫外檢測器。L-2000型高壓液相色譜;日本日立公司生產。5L/25型低溫冷卻循環泵，由鞏義市予華儀器有限責任公司生產;試劑均為分析純，

1.3 方法和條件

1.3.1 游離蒽醌的提取

將10 kg大黃干燥莖塊切片，粉碎后過2號篩，分別裝入5000 mL三角瓶，加入量為三角瓶容量的1/5，分別倒入95%的乙醇。置入超聲儀中超聲30 min，過濾出溶液后，回收溶劑。將回收的溶劑再倒入三角瓶，繼續超聲，重復以上操作3次，得到乙醇提取干浸膏。將乙醇干浸膏與氯仿按重量比1∶5比例置入三角瓶里萃取超聲，抽濾、濃縮萃取液，再將回收的溶劑重新倒入裝乙醇浸膏的瓶里繼續超聲萃取、抽濾、濃縮，重復3次得到游離蒽醌的氯仿萃取物。繼續將氯仿萃取后的渣置入三角瓶中，用20%的硫酸和氯仿在水浴上回流4～5 h，稍放冷，過濾，分離出氯仿層，用水洗至中性，回收氯仿后，得到游離蒽醌，合并2次提取物，得到總的游離蒽醌［4，5］。

1.3.2 大黃素的分離

1.2 文字圖像二值化 經過灰度處理的彩色圖像還須經過二值化處理將文字與背景進一步分離開。所謂二值化，就是將彩色值圖像信號轉化成只有黑（0）和白（1）的二值圖像信號。二值化效果的好壞，會直接影響灰度文本圖像的識別率。二值化處理的具體經驗有很多〔11-12〕，方法大致可以分為局部閾值二值化和整體閾值二值化。本文參考基于k中心點聚類的圖像二值化方法〔13〕，采用局部閾值二值化，將方塊苗文圖像分割為互不相交的若干個w×w的小窗口，在每個窗口中求得所轄像素的灰度平均值，經添加懲罰項后作為初步閾值進行二值化處理，繼而對各小方塊進行二值化變換，各個閾值的計算公式如下：

HSCCC兩相溶劑系統的組成是石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(體積比為8∶2∶8∶1)，混合前總體積為1L，充分搖勻后，在室溫下靜置過夜，使用前分離。上相作為固定相，下相作為流動相，上相與下相的體積比約為2∶3。用甲醇清洗逆流的管柱，然后用空氣壓縮機將甲醇吹出，用泵把固定相以10 mL/min速度泵入管柱，待管子的另一側有固定相出來后停止泵入固定相，然后主機反轉1100 r/min，以3 mL/ min泵入流動相，待流出來的液體與固定相的液體產生渾濁，繼續以3 mL/min泵入流動相，直到工作站上的基線走平則柱子已平衡，取干燥后的游離蒽醌的氯仿萃取物約200 mg，用20 mL流動相超聲溶解，超濾后(濾膜孔徑為0.45 μm)用注射器進樣;流動相的速度為3 mL/min;檢測器的波長為220 nm［6］。儀器檢測出峰時開始收集流份，其監測圖如圖1，根據圖1中的3個峰面積收集溶液，經TLC檢測，相同的化合物分為3組合并。

圖1 用HSCCC分離大黃素的監測圖Fig.1 Separation of emodin by HSCCC

1.3.3 蘆薈大黃素和大黃酸的分離

HSCCC兩相溶劑系統的組成是石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(體積比為3∶4∶3∶2)，對收集的第1組化合物繼續分離，HSCCC其他的操作條件和方法同1.3.2一樣。儀器檢測出峰時開始收集流份，其監測圖如圖2，根據圖2中的2個峰面積收集溶液。

圖2 用HSCCC分離蘆薈大黃素和大黃酸的監測圖Fig.2 Separation of aloe emodin and rhein by HSCCC

1.3.4 大黃酚和大黃素甲醚的分離

HSCCC兩相溶劑系統的組成是石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(體積比為12∶2∶12∶1)，對收集的第3組化合物繼續分離，HSCCC其他的操作方法同1.3.2一樣，儀器檢測出峰時開始收集流份。其監測圖如圖3根據圖3中的2個峰面積收集溶液，對收集的2個化合物重結晶，大黃酚用適量的乙酸乙酯在96℃下熱熔，過濾，室溫靜置析出黃色片晶，大黃素甲醚用適量丙酮在96℃下熱熔，過濾，室溫靜置析出金黃色針晶，2個晶體用石油醚洗晶。

圖3 用HSCCC分離大黃酚和大黃素甲醚的監測圖Fig.3 Separation of chrysophanol and rheochrysidin by HSCCC

1.3.5 高壓液相色譜檢測條件

色譜柱為Fortis C18(250*4.6 mm，5 μm);流動相A為甲醇∶乙酸乙酯(4∶1)加0.3%的甲酸;流動相B為0.3%甲酸;流速為1 mL/min;檢測波長為430 nm［7，8］進樣量為30 μL，用A和B梯度洗脫的條件為;當A的濃度為80%～95%時，洗脫時間為30 min，當A的濃度為95～100時，洗脫時間為15 min。

2 結果

當溶劑系統體積比為石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=8∶2∶8∶1時(圖1)，收集到的第一個峰的溶液，經TLC檢測為2個化合物，為蘆薈大黃素和大黃酸，第2個峰為大黃素，第3個峰為2個化合物，為大黃酚和大黃素甲醚。收集的第2個峰(大黃素)的液體放置12 h后自然結晶。當溶劑系統體積比為石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=3∶4∶3∶2時(圖2)，對收集第1個峰重新分離，重新分離后，收集到的第一個峰為蘆薈大黃素，第2個峰為大黃酸。當溶劑系統用石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水體積比為12∶2∶12∶1時(圖3)，對第3個峰重新分離，重新分離后，收集到的第一個峰為大黃酚，第2個峰為大黃素甲醚。

200 mg氯仿萃取物經過HSCCC分離得到大黃酸37.8 mg，得率為18.90%;大黃素32.1 mg，得率為16.05%;蘆薈大黃素11.7 mg，得率為5.85%;大黃酚40.9 mg，得率為20.45%;大黃素甲醚19.0 mg，得率為9.50%。

經高壓液相色譜用外標法檢測，大黃素單體純度為98.81%;大黃酸為99.15%;蘆薈大黃素98.51%;重結晶后大黃酚為98.89%;大黃素甲醚為98.16%。

蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的HPLC測試譜圖如圖4～8。

3 討論

用高速逆流分離游離蒽醌類化合物，選擇溶劑系統是關鍵［7］，如本試驗第一個溶劑系統選擇石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(體積比為8∶2∶8∶1)時，能從游離蒽醌中把大黃素分離為單體，而且單體不做重結晶，高壓液相色譜驗證純度在98%以上。對其它的化合物，也能做到初步分離，所有的溶劑系統只用了石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水這4種溶劑，分離時間短。經過初步分離后的化合物，只需改變系統溶劑比例，能達到化合物完全分離［8］。

1 Sun YY(孫媛媛)，Tang YH(唐玉海).Application of high speed countercurrent chromatography in separation of effective ingredients of Chinese medicine.Northwest Pharm(西北藥學雜志)，2003，18:282-283.

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3 Huang Y(黃園)，Xu XL(徐雄良)，Zhang ZR(張志榮)，et al.Study on purification process of total anthraquinone in Radix et Rhizoma Rhei decoction.Chin Tradit Patent Med(中成藥)，2003，25:783-785.

4 Zou HB(鄒華彬)，Wu B(吳波)，Du AQ(杜愛琴)，et al.Separation of the effective components from Rheum.Chem A-nal Comput(化學分析計量)，2002，11:13-15.

5 Zhang D(張德)，Cheng SP(程樹平)，Han HH(韓海洪)，et al.Extraction of rhapontinum from the roots of Rheum tanguticum Maxim by ultrasonic wave.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2005，17:217-219.

6 Yuan LM(袁黎明)，Xia T(夏滔)，Wu P(吳平)，et al.Preparative separation of crude extract from rhubarb by high speed countercurrent chromatography.Chem World(化學世界)，2002，43:185-186.

7Shi XG(時新剛)，Chen ZW(陳志偉)，Liu DW(劉東武).A review on application of high speed countercurrent chromatography.Life Sci Apparatus(生命科學器)，2009，8:3-6.

8 Yuan LM(袁黎明)，Li BF(李本發)，Wang D(王東)，et al.Separations of Rubia cordifolia L.，Polygonum cuspidatum and Cassia seed by high speed countercurrent chromatography.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2002，14: 57-59.

Separation of Anthraquinone from Rhubarb by High Speed Countercurrent Chromatography

YUAN Ping1，ZHOU Dong-bin2，LIN Shun-quan1，GAO Jun-fei1，HE Liu1，YUAN Xiao1*1Wuhan Botanical Garden，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430074，China;2PI＆PI Technologies Inc.，Guangzhou 510540，China

Five anthraquinones from Rhubarb were separated by high speed countercurrent chromatography.When twophase solvent system composition was petroleum ether:ethyl acetate:methanol:water(8∶2∶8∶1)，emodin was obtained.Rhein and aloe emodin were separated when the proportion of solvents was 3∶4∶3∶2，while chrysophanol and rheochrysidin were separated at the proportion of solvents 12∶2∶12∶1.The purities of emodin，rhein，aloe emodin，chrysophanol and rheochrysidin are 98.81%，99.15%，98.51%，98.89%and 98.16%respectively by HPLC.

high speed countercurrent chromatography;aloe emodin;rhein;emodin;chrysophanol;rheochrysidin;separation

1001-6880(2011)04-0739-04

2010-03-08 接受日期:2010-06-17

國家科技基礎專項項目(2008FY230400)

*通訊作者 Tel:86-013871483413;E-mail:yuanxiao@yahoo.com

R284.2;Q946.91

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