胍乙酸殼聚糖的合成及其對黃瓜的保鮮研究

曾 涵，趙淑賢，張 雷，王永疆

1新疆師范大學生命科學與化學學院，烏魯木齊830054;2新疆農業大學附屬中學，烏魯木齊830052

胍乙酸殼聚糖的合成及其對黃瓜的保鮮研究

曾 涵1*，趙淑賢1，張 雷2，王永疆1

1新疆師范大學生命科學與化學學院，烏魯木齊830054;2新疆農業大學附屬中學，烏魯木齊830052

以自制的不同脫乙酰度的殼聚糖和1-氯胍乙酸為原料合成了胍乙酸殼聚糖，研究了胍乙酸殼聚糖對黃瓜的保鮮效果。結果表明，由脫乙酰度為96%的殼聚糖制得的胍乙酸殼聚糖平均分子量為5287。隨著脫乙酰度的增加，黃瓜失重率的增加逐漸減緩，隨著貯存時間延長總葉綠素含量先升高然后緩慢下降，而維生素C含量則一直緩慢下降;脫乙酰度為96%的殼聚糖制得的胍乙酸殼聚糖貯存35 d后，黃瓜的質量損失為0.7%;貯存20 d后，總葉綠素含量仍然可達1.34 mg/g;貯存時間20 d后，維生素C含量可達0.18 mg/g。

胍乙酸殼聚糖;黃瓜;涂膜;保鮮

殼聚糖由于安全，無毒副作用且成膜性好，目前已經應用于辣椒、番茄、草莓等的保鮮研究［1-5］。歐春艷等［6］首先研究了不同脫乙酰度的殼聚糖對黃瓜的保鮮效果，但是在保存7 d之后，黃瓜的性狀便發生了明顯改變，可見殼聚糖保鮮能力有限。胍基本身具有良好的生物相容性，胍乙酸又是一種具有較好生理活性的有機物，在生理條件下處于完全質子化狀態，是形成配體和受體、酶和底物之間氫鍵、靜電力等相互作用的基礎，但其對細胞表面缺乏親和力，在細胞表面無法成膜，吸濕保濕性能不穩定［7］。前文［8］結合這二者的優點，合成了既具有良好的吸濕保濕性，又具有良好生理活性的胍乙酸殼聚糖(GAAC)。在此基礎上，采用以微波加熱代替常規加熱制備得到的殼聚糖并進行胍乙酸化，研究了胍乙酸殼聚糖涂膜處理后的黃瓜失重率，總葉綠素含量及維生素C含量等隨著貯存時間的變化關系，類似研究目前尚未見報道。經胍乙酸殼聚糖接枝物涂膜處理，黃瓜貯存35 d后失重率僅為0.7%，不到文獻［6］報道的一半;貯存20 d后，總葉綠素含量仍然可達1.34 mg/g，維生素C含量可達到0.18 mg/g，而文獻［6］報道的脫乙酰度為90%的殼聚糖涂膜處理，黃瓜貯存20 d后總葉綠素含量僅有0.7 mg/g，維生素C含量僅有0.11 mg/g。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

WP-750A型微波爐，WNZK-01溫度控制儀，NDJ-1型旋轉式粘度計，將干燥試樣溶解于0.1 mol/L NaCl溶液中，按一點法進行特性粘度的測定;76型電動攪拌機，AL104數字式電子天平(德國梅特勒公司)，BRUKER EQUINDX-55型紅外光譜儀(德國 BRUKER公司)，KBr壓片;JEOL JNMECP600M型核磁共振儀(日本JEOL公司)，溶劑D2O，TMS為標樣;Y-4Q型X-射線衍射儀(荷蘭飛利浦公司);PHS-25型PH計(上海雷磁儀器廠); DDS-L型電導率儀(深圳市統奧科技有限公司); Waters(Model510)凝膠滲透色譜儀(GPC)(美國Waters公司)，流動相為THF(四氫呋喃)，用窄分布的聚苯乙烯樣品作為標樣。

1-氯胍乙酸、NaOH、HCl、草酸、高錳酸鉀、甘氨酸、丙酮、甲醛、冰乙酸、溴乙烷、硫脲、紅磷和乙醚均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 殼聚糖的制備

將10 g經過水洗后的蝦殼用200 mL 2 mol/L NaOH溶液浸泡，用320W功率的微波輻照5 min后，冷至室溫浸泡12 h，再用質量分數為10%NaCl溶液浸泡4 h后沖洗，除去蝦殼中的蛋白質，重復此步驟3～4次后用水洗至中性，再用250 mL 2 mol/L HCl溶液在室溫下浸泡24 h，使碳酸鈣轉化為氯化鈣，用水洗至中性，干燥，粉碎后，加入質量分數為2%的高錳酸鉀溶液，浸泡1 h脫色，水洗后以質量分數60%～70%草酸處理20 min，得白色片狀結晶甲殼素。

將甲殼素在35%的NaOH溶液中用500W功率微波輻照10 min，得到脫乙酰基的殼聚糖，再加入質量分數2%稀醋酸將其溶解，過濾去除雜質后，濾液中加入堿，析出殼聚糖。粗甲克素按上述步驟處理不同時間可得不同脫乙酰度的殼聚糖:處理時間分別為4.3、5.2、6.4、7.9和9.4 h時可分別得到脫乙酰度為30、50、70、90和96%的殼聚糖。

農村經濟是社會經濟穩步發展的主要推動力，在新農村建設中，群眾的生活水平得到了顯著提高，但也出現了影響新農村建設的不利因素，其中農村人畜用水安全就是影響新農村建設的主要因素之一。現階段我國農村普遍存在水資源短缺的現象，雖然我國農村地區已經修建了一些人畜飲水工程，但是由于管理不力等方面的因素，人畜飲水工程的效益并沒有得到充分發揮。

1.2.2 胍乙酸殼聚糖合成

按文獻［8］方法合成。合成步驟簡述如下:稱取約3.8 g干燥殼聚糖固體，加入10 mL質量分數為50%的NaOH溶液堿化，再依次加入約20 mL異丙醇及1-氯胍乙酸3.0 g，室溫反應2 h，并不時攪拌，待殼聚糖固體緩慢溶解后再加熱2 h(溫度保持在70℃)，攪拌下冷卻至室溫(約30 min)，加無水冰醋酸調pH至中性，有白色粘稠狀固體生成，充分攪拌，加無水乙醚攪拌，抽濾，于80℃烘箱內干燥，研碎得白色胍乙酸殼聚糖粉末(以不同脫乙酰度的殼聚糖為原料與1-氯胍乙酸反應可得不同脫乙酰度的胍乙酸殼聚糖)。

1.2.3 脫蛋白質量的測定

采用甲醛滴定氨基氮法［9］用pH計測得微波脫蛋白液中氨基氮含量為1.642 g/L。

1.2.4 脫乙酰度的測定

以電導率為縱坐標，NaOH溶液的消耗量(mL)為橫坐標作圖，通過一階，二階微分求拐點，按文獻［10］方法求出殼聚糖的脫乙酰度。

1.2.5 失重率測定

稱取不同脫乙酰度的GAAC各1.0000 g，加入100 mL質量分數為1.5%的稀醋酸溶液，攪拌溶解后得10 g/L的GAAC溶液。將黃瓜隨機分組，每組5個，分別將配好的涂膜液覆于黃瓜表面，涂抹均勻，然后把黃瓜放在通風處，自然風干，稱重，用保鮮袋裝好，室溫下貯藏。

1.2.6 葉綠素含量測定

按下式［11］求得總葉綠素含量:

式中A為吸光度，m為所用鮮黃瓜表皮質量(g)，V為葉綠素丙酮提取液的體積(mL)

1.2.7 維生素C含量測定

圖1 殼聚糖脫乙酰度隨處理時間的變化關系Fig.1 Relation between chitosan deacetylation and disposal durance

用微波消解不同脫乙酰度的殼聚糖涂膜液處理過的黃瓜，用間接碘量法［12］測定其中維生素C含量。

2 結果與討論

2.1 胍乙酸殼聚糖(GAAC)的結構分析

殼聚糖的脫乙酰度測定結果如圖1所示。由圖1可以看出:在起始的4 h內，反應很慢，隨著處理時間的延長，脫乙酰度迅速增加，10 h以后甲殼素上的乙酰基已經基本上被脫除。

GAAC:IR(KBr)υ/cm-1:3480(N-H);1425，1621(COO-);1560(guanyl);924(sugar ring，C1-H)。1H NMR δ:3.4～4.2(m，5H，sugar ring 2，3，4，5，6-H);4.46～5.06(m，3H，sugar ring-OH);9.70 (d，J=9.0 Hz，1H，NH);4.56(t，J=9.3 Hz，1H，sugar C1-H)。殼聚糖的XRD圖譜中2θ為10°、18°、45°、66°和79°處有5個強結晶峰。GAAC的XRD圖譜上，只有20°和47°的2個弱峰，其強度只有殼聚糖XRD圖譜中與之相接近的18°和45°峰強度的31%和44%;殼聚糖的其余結晶峰全部消失，說明引入的胍基破壞了殼聚糖的結晶結構，這也是GAAC水溶性增高的原因。

按照文獻［13］方法測得由脫乙酰度為96%的殼聚糖制備的 GAAC的聚合度為8.51，取代度為0.43，炭化點≥186℃，測得粘度為292 mPa.s，由GPC測得分子量為5287，分子量分布指數為2.31，GAAC在水中的溶解度(25℃)為:0.41 g·L-1。其分子結構如圖2所示:

圖2 GAAC分子結構圖示Fig.2 Diagram of GAAC molecular structure

2.2 黃瓜的質量損失率

黃瓜失重率計算方法公式:質量損失%=(mo–mt)/mo×100%。式中mo和mt分別為黃瓜的原始質量和每天稱重的質量(g)，實驗結果見圖3。

圖3 黃瓜失重率與貯存時間的關系Fig.3 Relation between storage durance and weightloss.Deacetylation/%:1.0，2.30，3.50，4.70，5.90，6.96

由圖3可以看出:各涂膜組黃瓜的失重率均低于對照組，其中經脫乙酰度高的涂膜液處理的黃瓜失重率最低。在低臨界溶解溫度和動態接觸濃度之下，GAAC分子可以有效地吸附在細胞表面而不會被細胞吸收，達到抑制水分流失的作用。此外，GAAC的抑菌作用也增強了保鮮效果［14］。文獻［6］報道以脫乙酰度為85%的殼聚糖涂膜的黃瓜貯存20 d后失重率可達1.6%，而本文合成的胍乙酸殼聚糖(其中作為原料的殼聚糖脫乙酰度為96%)作保鮮劑給黃瓜涂膜，貯存35 d后的失重率僅為0.7%。

2.3 黃瓜中葉綠素含量的變化

圖4 貯存時間對黃瓜葉綠素含量的影響Fig.4 Influence of storage durance on total concentration of Chlorophyll in cucumber.Deacetylation/%:1∶0，2∶30，3∶50，4∶70，5∶90，6∶96

黃瓜葉綠素含量隨貯存期的變化見圖4，可以看出隨著貯藏時間增長，對照組的葉綠素含量逐漸減少，而經涂膜處理過的黃瓜中的葉綠素含量則會先顯著上升而后逐漸下降。這是因為黃瓜在用GAAC涂膜保鮮時，類似于微環境下的MA(Modified atmosphere)保藏，膜內的CO2含量隨時間延長而增加，從而減緩葉綠素的降解。葉綠素酶活性中心與GAAC可能通過螯合或氫鍵作用相結合使酶活性中心構象發生扭曲，導致酶活力下降(與GAAC結合后的葉綠素酶的活性降低為游離葉綠素酶活性的30%［14-16］);同時這種酶和GAAC的選擇性結合也增大了底物葉綠素與酶空間上的分隔，從而阻止了葉綠體膜的崩潰瓦解，這意味著單位時間和體積內葉綠素降解速度顯著減慢，表觀上測定的葉綠素濃度便“上升”了。文獻［6］報道當以脫乙酰度為90%的殼聚糖涂膜黃瓜表面，貯存20 d后測得的總葉綠素含量下降到0.7 mg/g，而以胍乙酸殼聚糖(其中作為原料的殼聚糖的脫乙酰度為96%)作為保鮮劑給黃瓜涂膜貯存20 d后，總葉綠素含量為1.34 mg/ g。

2.4 黃瓜中維生素C含量的變化

圖5 黃瓜中維生素C含量與貯存時間的關系Fig.5 Relation between storage durance and content of Vitamin C in cucumber.Deacetylation/%∶1∶0，2∶30，3∶50，4∶70，5∶90;6∶96

黃瓜中維生素C含量隨貯存時間的變化見圖5。可以看出:隨著貯藏時間的延長，涂膜組和對照組的維生素C含量都明顯減少，但經GAAC涂膜后黃瓜中維生素C含量的降低速率明顯低于對照組。這是由于GAAC涂膜顯著地減少了黃瓜體內外的氣體交換，從而使維生素C的損失減少。覆蓋于細胞表面的GAAC分子可形成有效的保護膜，部分抑制了電子在細胞膜內外的遷移并導致維生素C的峰電流下降，電位也發生相應的變化［16］。綜上所述，隨著殼聚糖的脫乙酰度提高保鮮劑的保鮮效果增強，這可以解釋為:一方面是由于脫乙酰度的提高使游離NH2基團增多，從而可連接更多的胍乙酸基。胍乙酸基團中C=N鍵對鄰近N原子的強烈吸電子作用，使其更容易被親核性細胞膜吸附，另一方面則是因為連接的胍乙酸基越多，改變了葉綠素酶的空間結構，使其翻譯后修飾步驟受到阻礙，導致降解速度下降從而起到保鮮作用［15，16］。另外，此種保鮮劑的保鮮效果要超過文獻［6］報道的同樣條件下脫乙酰度為90%的殼聚糖對黃瓜的保鮮效果大約50%。文獻［6］報道的以脫乙酰度為90%的殼聚糖涂膜黃瓜表面，貯存20 d后測得的維生素C含量僅為0.11 mg/g，而以脫乙酰度為96%的殼聚糖為原料制備的胍乙酸殼聚糖作保鮮劑給黃瓜涂膜后貯存20 d后，測定的黃瓜中維生素C含量為0.18 mg/g。這是因為:一方面GAAC分子可以憑借多個基團的氫鍵，靜電引力等作用相對于殼聚糖分子而言更穩定地吸附于細胞膜表面;另一方面則是胍乙酸基與葉綠素酶基因中N端的序列發生作用，改變了葉綠素酶翻譯后修飾的歷程，從而改變了葉綠素的降解速度［15，16］。

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Synthesis of Guanidyl Acetic Acid Chitosan And Preservation Effect of Cucumbers

ZENG Han1*，ZHAO Shu-xian1，ZHANG Lei2，WANG Yong-jiang11College of Life Science and chemistry，Xing Jiang Normal University，Urumuqi 830054，China;2Accessory Middle School of Xin Jiang Agricultural School，Urumuqi 830052，China

Guanidyl acetic acid chitosan(GAAC)has been synthesized by self-made chitosan and chloro-guanidinyl acetate as raw materials and was used as cucumber preservative.The results from experiment indicated average molecular weight of guanidyl acetic acid chitosan prepared from chitosan with deacetylation of 96%was 5287 g/mol.Effects of coating with a series of different deacetylation of GAAC as fresh-keeper for cucumber stored at room temperature had been examined.Weight-loss rate slowed down gradually with increase of chitosan deacetylation.Consistency of total chlorophyll increases first and then decreases gradually while storage period lapses.In contrast，concentration of vitamin C declines slightly while storage duration prolongs.When storage duration of GAAC prepared from chitosan with deacetylation of 96%is 35 d，weight-loss rate is about 0.7%;storage duration:20 d，concentration of total chlorophyll still amounts to 1.34 mg/g;while consistency of vitamin C can retain 0.18 mg/g，storage duration 20 d.

guanidyl acetic acid chitosan(GAAC);cucumber;coating film;fresh-keeping

1001-6880(2011)03-0504-05

2010-01-05 接受日期:2010-04-27

*通訊作者 E-mail:zenghan1289@163.com

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