藏藥蕨麻多糖的光譜性質(zhì)及單糖組成分析

夏 蓮，孫志偉，李國(guó)梁，索有瑞，尤進(jìn)茂，2*

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧810001;2山東省曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院生命有機(jī)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，曲阜273165;3中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京1000491

藏藥蕨麻多糖的光譜性質(zhì)及單糖組成分析

夏 蓮1，2，3，孫志偉1，3，李國(guó)梁1，3，索有瑞1，尤進(jìn)茂1，2*

1中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧810001;2山東省曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院生命有機(jī)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，曲阜273165;3中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京1000491

本研究對(duì)藏藥蕨麻多糖進(jìn)行了分離提純，并測(cè)定其水溶性多糖含量為99.4%;通過紫外光譜與紅外光譜分析表明，蕨麻多糖為分子量較小的α-吡喃糖，并含有氨基糖;蕨麻多糖的水解單糖經(jīng)過NMP衍生后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，測(cè)得其單糖組成為木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，含量分別為3.945、77.445、17.568、17.646、3.942、2.165、65.268、13.037 μg/mg和33.484 μg/mg，與GC-MS的定性分析結(jié)果一致。

蕨麻;多糖;光譜性質(zhì);單糖組成

蕨麻(Potentilla anserine L.)為薔薇科委陵菜屬植物鵝絨委陵菜的根，為藏醫(yī)常用藥，又名戳瑪、卓老灑曾、延壽果、人參果、仙人果等。蕨麻分布很廣，但據(jù)《新華本草綱要》記載“只在青藏高原，本種始有塊根發(fā)育”［1］。本藥具有應(yīng)用歷史悠久、民族藥特征明顯等特點(diǎn)，深受藏族同胞的喜愛，是當(dāng)?shù)厝说摹俺Ｓ蒙纤帯保?］。現(xiàn)代藥理學(xué)表明:蕨麻具有健脾胃、收斂止血、補(bǔ)血益氣、生津利痰之功效，主治脾虛腹瀉、貧血及營(yíng)養(yǎng)不良等癥［3］，另有報(bào)道蕨麻具有治療黃疸性及病毒性肝炎的功效［4，5］。據(jù)文獻(xiàn)記載，蕨麻中含有糅質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)、脂肪酸及委陵菜苷等成分［6-9］，但對(duì)蕨麻多糖的研究還僅限于總糖含量的測(cè)定［10，11］。

研究表明，多糖類物質(zhì)不僅具能夠提高免疫系統(tǒng)功能，而且具有較高的抗癌等生物活性［12，13］。不同植物中提取的多糖其生物活性也有很大差別，主要取決于多糖的單糖組成，分子量以及鏈構(gòu)象［14］。因此，對(duì)多糖的單糖組成分析具有重要意義。本研究利用紫外光譜、紅外光譜、毛細(xì)管電泳以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法對(duì)蕨麻多糖的單糖組成進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用藏藥蕨麻提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑及主要儀器

蕨麻植物樣品8月份采自青海玉樹地區(qū)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所藏藥中心周昌范研究員鑒定。

1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)由本實(shí)驗(yàn)室合成［15］;單糖標(biāo)準(zhǔn)品(sigma公司，美國(guó));硼砂(分析純，徐州試劑二廠);水為Milli-Q超純水;其它試劑均為分析純。

CARY 300紫外可見光度計(jì)(Varian公司)，Nicolet 10DX-FTIR紅外光譜儀。HP6890和HP5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)，HP-3D毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)，Agilent公司)，配備二極管陣列檢測(cè)器;毛細(xì)管，總長(zhǎng)58.5 cm，有效長(zhǎng)度50 cm，內(nèi)徑50 μm(河北省永年銳灃色譜器件有限公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蕨麻多糖的提取、分離純化及水解

干燥、研細(xì)的蕨麻根塊100 g，加100 mL乙醇和乙醚(體積比1∶1)混合液，65℃水浴回流3 h去脂，抽濾，沉淀物溶于100 mL 85%的乙醇，超聲波提取30 min去單糖，抽濾，沉淀物加水溶解后超聲波提取90 min，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液，得60 mL粘稠液，補(bǔ)加3倍體積95%的乙醇，靜止放置24 h，離心，沉淀物加水溶解后用氯仿-正丁醇(體積比4∶1)萃取三次(脫蛋白);上清液繼續(xù)補(bǔ)加95%乙醇至乙醇濃度為90%，放置24 h，離心沉淀，沉淀物于70℃烘干，得蕨麻粗多糖。

取蕨麻粗多糖10 mg于安培瓶中，加3 mol/L的三氟乙酸2 mL溶解后封口，于110℃下水解10 h，放冷后N2吹干。

1.2.2 總糖含量的測(cè)定

精密量取1 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液0.05，0.25，0.75，1.0，1.25 mL，分別置于10 mL具塞試管中，加水稀釋至10 mL。準(zhǔn)確加入5%的苯酚溶液1 mL，混勻，冰水浴，再精密加入濃硫酸5 mL后98℃水浴加熱20 min，自來水水浴冷卻5 min，室溫放置10 min，以空白溶液為對(duì)照于488 nm處測(cè)吸光度。以吸光度(A)對(duì)葡萄糖檢測(cè)濃度(C)進(jìn)行線性回歸。

吸取10 μg/mL的樣品液1 mL，測(cè)定吸光度，多次測(cè)量取平均值，通過回歸方程求得相應(yīng)糖濃度值，計(jì)算總糖含量。

1.2.3 蕨麻多糖紫外-可見光譜與紅外光譜分析

制備0.1 mg/mL-1蕨麻多糖水溶液，在400～190 nm范圍內(nèi)掃描;蕨麻多糖以溴化鉀壓片，在波數(shù)4000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.4 蕨麻多糖水解單糖的毛細(xì)管電泳分析

NMP的標(biāo)記過程:向2 mL安瓿瓶中加入200 μL(0.05 M)NMP乙腈溶液、20 μL單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液(0.01 M)、20 μL 17%氨水，封口后于70℃水浴中反應(yīng)35 min，取出放冷后用氮?dú)獯蹈桑? mL乙腈-水(體積比為4∶1)溶解后進(jìn)樣分析。

毛細(xì)管電泳條件:采用58.5 cm×50 μm id毛細(xì)管(有效柱長(zhǎng)50 cm)，55 mmol/L硼酸鹽緩沖溶液(pH 9.46)，柱溫20℃，分離電壓22 kV，進(jìn)樣10 s，不加任何添加劑。

1.2.5 蕨麻多糖水解單糖的氣相色譜-質(zhì)譜分析

乙酰化過程:取10 mg蕨麻多糖經(jīng)水解后，加入鹽酸羥胺5.0 mg，吡啶100 μL，振蕩混勻，放入90℃水浴中加熱反應(yīng)30 min。取出后冷卻至室溫，加100 μL醋酸酐，90℃下繼續(xù)反應(yīng)30 min進(jìn)行乙酰化，冷卻至室溫，70℃水浴中將反應(yīng)產(chǎn)物用N2吹干，加入800 μL氯仿重新溶解，取1 μL進(jìn)行GC-MS分析。

氣相色譜分析條件:載氣為高純氦氣;進(jìn)樣口溫度280℃;程序升溫，起始溫度100℃，以10℃/min升至170℃，再以5℃/min升至260℃，保持5 min;載氣流速1.2 mL/min，分流比20∶1;EI離子源，電子能量70 eV;質(zhì)荷比掃描范圍55～550，離子源溫度230℃，接口溫度280℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 蕨麻多糖的提取率及總糖含量

蕨麻塊根經(jīng)去脂、去單糖后，利用水提醇沉法提取粗多糖，經(jīng)savage法除蛋，得多糖252.0 mg。

以吸光度(A)對(duì)葡萄糖檢測(cè)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 C=0.2137A-0.0159(r= 0.9994)。結(jié)果表明，葡萄糖檢測(cè)濃度在22.31～114.03 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。由回歸方程計(jì)算得蕨麻多糖水溶性多糖的含量為98.4%

2.2 蕨麻多糖紫外-可見光譜分析

紫外光譜圖中，195 nm處顯示多糖的特征吸收，在260 nm和280 nm處無蛋白、核酸吸收峰［16］，表明多糖中無蛋白、多肽及核酸的存在。

2.3 蕨麻多糖的紅外光譜分析

圖1 蕨麻多糖的紅外光譜圖Fig.1 The IR spectrum of polysaccharide from Potentilla anserine L.

蕨麻多糖經(jīng)紅外光譜分析如圖1，在3600～3200、3200～2800、1400～1200 cm-1和1200～1000 cm-1，這4個(gè)譜段內(nèi)都出現(xiàn)了典型多糖物質(zhì)的吸收峰，分別為O-H鍵和分子內(nèi)或分子間氫鍵的伸縮震動(dòng)，C-H鍵的伸縮震動(dòng)，C-H變角震動(dòng)，C-O-H和吡喃環(huán)的C-O-C兩種C-O鍵形成的伸縮震動(dòng)，1630 cm-1附近的吸收峰為酰胺基團(tuán)中乙酰基的特征吸收，表明蕨麻多糖中有氨基糖的存在;在845.45 cm-1處的吸收為α-吡喃型糖的的特征吸收，而890 cm-1附近無吸收，說明蕨麻多糖成苷的半縮醛羥基主要為α構(gòu)型的吡喃糖，而沒有β構(gòu)型;2921 cm-1處的吸收峰不明顯，提示其分子結(jié)構(gòu)中甲基和亞甲基含量比較小［17］，體現(xiàn)為分子鏈較短，相對(duì)分子量較小。

2.4 蕨麻多糖水解單糖的毛細(xì)管電泳分析

單糖缺乏常規(guī)的紫外生色基團(tuán)，所以單糖的衍生化是獲得高靈敏紫外檢測(cè)的必要步驟。Suzuki等［18］以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)為衍生試劑，利用活潑碳(C-4)和還原糖的還原端之間的縮合反應(yīng)進(jìn)行糖類的測(cè)定。本文以本課題組合成的1-萘基-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)作柱前衍生劑，實(shí)現(xiàn)了蕨麻多糖水解單糖在毛細(xì)管區(qū)帶電泳模式下的分離和定量，為蕨麻多糖的應(yīng)用開發(fā)提供了可靠理論依據(jù)。單糖衍生反應(yīng)過程見圖2(以甘露糖為代表單糖)。

圖21 -(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)與還原性單糖衍生反應(yīng)示意圖Fig.2 Derivatization scheme of 1-(2-naphthyl)-3-methyl-5-pyrazolone(NMP)with reductive saccharides

NMP標(biāo)記的糖類衍生物在250～5 μmol/L范圍內(nèi)，依據(jù)峰面積對(duì)單糖濃度進(jìn)行線性回歸，所得各單糖衍生物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表1。

表1 單糖衍生物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限及保留時(shí)間和峰面積的重現(xiàn)性(n=6)Table 1 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and repeatabilities for peak area and retention time of saccharide derivatives(n=6)

*Y:峰面積(peak Area)，X:單糖濃度(concentration of monosaccharide)，μmol/L.

蕨麻多糖水解單糖按上述方法衍生后進(jìn)樣分析，電泳分離見圖3。用線性回歸方程定量，經(jīng)多次測(cè)量得單糖含量見圖4。圖中峰1、峰2、峰3為未知成分，推測(cè)為氨基糖。

圖3 蕨麻多糖水解單糖的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離圖Fig.3 Chromatograms of saccharides from Potentilla anserine L.sample by capillary zone electrophoresis

圖4 蕨麻多糖中各單糖含量Fig.4 Quantitative of saccharides separated from Potentilla anserine L.

2.5 蕨麻多糖水解單糖的氣相色譜-質(zhì)譜分析

圖5 蕨麻多糖水解單糖乙酰化衍生物的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of acetylated derivatives of saccharides from Potentilla anserine L.sample

蕨麻多糖水解單糖經(jīng)乙酰化后，用GC-MS分析其單糖組成，總粒子流圖見圖5。結(jié)果顯示:蕨麻多糖的組成單糖主要為鼠李糖(1，Rha)、巖藻糖(2，F(xiàn)uc)、阿拉伯糖(3，Ara)、木糖(4，Xyl)、甘露糖(5，Man)、葡萄糖(6，Glc)和半乳糖(7，Gal)，與毛細(xì)管電泳分析結(jié)果一致。由于糖醛酸容易發(fā)生內(nèi)酯化，直接乙酰化衍生非常困難［19］，因此蕨麻多糖水解單糖的GC-MS分析，兩種糖醛酸未能檢測(cè)到。

3 結(jié)論

蕨麻多糖經(jīng)提取、分離純化后，進(jìn)行總糖含量的測(cè)定，結(jié)果顯示，蕨麻多糖總糖含量為98.4%;紫外光譜分析表明，在195 nm有多糖的特征吸收，而沒有蛋白、多肽及核酸存在;紅外光譜分析結(jié)果顯示，845.45、1630 cm-1附近的吸收分別為α-吡喃型糖的的特征吸收和酰胺基團(tuán)中乙酰基的特征吸收，且甲基、的特征吸收2921 cm-1不明顯，因此，蕨麻多糖為分子量較小的α-吡喃糖，并含有氨基糖。毛細(xì)管電泳分析顯示，蕨麻多糖的單糖組成主要是木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，含量分別為3.945、77.445、17.568、17.646、3.942、2.165、65.268、13.037 μg/ mg和33.484 μg/mg，與GC-MS的定性分析結(jié)果一致。本文對(duì)藏藥多糖的單糖組成的定性定量分析為蕨麻在食品、醫(yī)藥和保健方面的開發(fā)應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

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Spectral Properties and Monosaccharides Compositon Analysis of Polysaccharide from Potentilla anserina L.

XIA Lian1，2，3，SUN Zhi-wei1，3，LI Guo-liang1，3，SUO You-rui1，YOU Jin-mao1，2*1Key Laboratory of Life-Organic Analysis of Shandong Province，College of Chemistry Science，Qufu Normal University，Qufu 273165，China;2Northwest Plateau Institute of Biology，the Chinese Academy of Sciences，Xining 810001，China;3Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing，100049，China

The polysaccharide of Potentilla anserine L.was extracted and purified，and its contents was determined as 98.4%by phenyl-sulfuric acid method.The polysaccharide was identified by IR spectrum and UV scanning spectrum.The IR spectrum indicates that the characteristic absorption peaks at 3600-3200，3200-2800，1400-1200，1200-1000 cm-1，and 845 cm-1belonged the characteristic peak of α-pyranose.In addition，the peak at 1630 cm-1assigned to the C=O of acetamide moiety stretching vibration meant that amino sugars exited in the polysaccharide.A method was developed for the separation of derivatized carbohydrates of Potentilla anserine L.using 1-naphthyl-3-methyl-5-pyrazolone(NMP)as derivatization reagent by capillary zone electrophoresis，and the results shows that the monosaccharides compositions of the polysaccharide from Potentilla anserine L.are xylose，arabinose，glucose，rhamnose，mannose，fucose，galactose，glucuronic acid and galacturonic acid with contents of 3.945，77.445，17.568，17.646，3.942，2.165，65.268，13.037 μg/ mg，and 33.484 μg/mg，respectively，which are consistent with the results carried out by GC-MS.

Potentilla anserine L.;polysaccharide;spectral properties;monosaccharide composition

1001-6880(2011)03-0453-05

2009-10-15 接受日期:2010-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金(20075016);中國(guó)科學(xué)院“百人計(jì)劃”項(xiàng)目(328)

*通訊作者 E-mail:jmyou6304@163.com

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