不同ω-3/ω-6構成比的配伍紅花籽油對SH-SY5Y細胞氧化損傷的預防效應

吳 迪，吳桂榮，阿布力孜·阿布杜拉，盛 磊，巴哈爾古麗·卡哈爾*

1新疆醫科大學藥學院藥化有機教研室; 2新疆醫科大學新疆地方病分子生物學重點實驗室，烏魯木齊830011

不同ω-3/ω-6構成比的配伍紅花籽油對SH-SY5Y細胞氧化損傷的預防效應

吳 迪1，吳桂榮1，阿布力孜·阿布杜拉2，盛 磊2，巴哈爾古麗·卡哈爾1*

1新疆醫科大學藥學院藥化有機教研室;2新疆醫科大學新疆地方病分子生物學重點實驗室，烏魯木齊830011

探討不同ω-3/ω-6構成比的配伍紅花籽油(Compatibility Safflower Seed Oil，CSSO)預防神經細胞氧化損傷的作用。通過過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)氧自由基供體誘導，建立人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞氧化損傷模型;以不同濃度和ω-3/ω-6構成比的CSSO進行細胞藥物干預，利用四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和流式細胞儀檢測細胞活力變化和細胞凋亡率。我們建立了H2O2誘導的SH-SY5Y細胞氧化損傷模型，其IC50值為1089.54 μmol/L H2O2;隨著ω-3相對含量遞減，CSSO預防細胞氧化損傷的效應增加，且當ω-3/ω-6比例為1∶6.68和有效濃度范圍為375～750 μg CSSO/mL時，其藥物干預組細胞活力(84.1%)顯著高于模型組(61.1%)，而藥物干預組細胞凋亡率(12.6%)明顯低于模型組(25.9%)。從以上結果可以推測，CSSO能夠保護細胞并預防氧自由基誘導的細胞損傷，其效果可能與CSSO中ω-3/ω-6構成比密切相關。

配伍紅花籽油;氧化損傷;SH-SY5Y;MTT

配伍紅花籽油(Compatibility Safflower Seed Oil， CSSO)是由新疆地產紅花籽油與胡麻油皂化產物混酸以一定的比例配伍而成的創新配伍使用油，主要有效成分為ω-3、ω-6多不飽和脂肪酸。以往的研究證實，CSSO具有降血脂［1］、防止動脈粥樣硬化、抗凝血、防止血栓形成等藥理作用［2］。此外，CSSO對于腦、視網膜、神經組織發育具有一定的調節作用［3］。本研究擬建立H2O2誘導的神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)氧化損傷模型，以原料紅花籽油(Safflower Seed Oil，SSO)，混酸(Mix-Polyunsaturated fatty acid，Mix-PUFA)及不同ω-3/ω-6構成比的CSSO干預細胞，研究CSSO保護神經細胞并預防自由氧基引起的細胞氧化損傷的效應，為更好的利用新疆紅花資源和新藥研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

SH-SY5Y細胞由中國科學院上海分院細胞庫提供。D-MEM/F12培養基、胎牛血清(GIBCO公司);四甲基偶氮唑藍(MTT)、抗菌素、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、磷酸平衡鹽(PBS)(Sigma和Invitrogen公司);Annexin V-FITC試劑盒(Calbiochem公司);細胞培養所需的低值易耗品來自Corning或Exogen公司。不同比例配伍紅花籽油由新疆醫科大學藥學院藥化有機教研室紅花課題組提供。CO2孵育箱(HERA cell 150，Thermo公司);生物安全柜(KS18，Thermo公司);倒置顯微鏡(BH-2，Olympus公司);臺式離心機(3-18K，Sigma公司);酶標儀(AD 340，Beckmann Coulter);流式細胞儀(LSRⅡ，BD公司)。

1.2 細胞培養

配制含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的D-MEM/F12養基，在5%CO2和37℃條件下培養SH-SY5Y細胞，每隔1 d更換一次培養基，待細胞融合度達80%～90%時，用胰蛋白酶(0.25%)消化法以1∶2的比例傳代。

1.3 不同ω-3/ω-6構成比的CSSO母液制備

以1∶4比例(v/v)將CSSO溶于DMSO，配制0.25 g/mL的CSSO母液，并在使用時，用D-MEM/ F12完全培養基稀釋藥物至所需濃度(培養基中DMSO終濃度約為0.7%)。

1.4 MTT法檢測細胞活力

取對數生長期的SH-SY5Y細胞，接種于96孔板(密度為3×105個/mL)，每孔200 μL，按預定濃度進行各種藥物或試劑(CSSO、H2O2)干預后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，并換成等體積的無血清培養基。在37℃和5%CO2細胞孵育箱培養4 h后，棄去培養基，加入150 μL DMSO，待細胞內紫色結晶溶解后，利用酶標儀測定其570 nm處吸光度值(OD值)，并判斷細胞活力。細胞活力及抑制率分別按以下公式計算:

1.5 細胞凋亡率的流式細胞儀檢測

選擇對數生長期的SH-SY5Y細胞，以4×106個/mL的密度種植于25 cm2培養瓶，每瓶1 mL，培養20～24 h后進行藥物干預。待所有藥物干預過程完成后，收集細胞，參照Annexin V-FITC試劑盒說明書處理細胞，并于流式細胞儀測定細胞凋亡率，主要步驟包括:細胞懸浮、結合Annexin V-FITC(1.25 μL)和碘化丙啶(PI，10 μL)，以及流式細胞儀檢測。流式細胞儀分析條件:激發波長Ex=488 nm;發射波長Em=530 nm。

1.6 統計分析

用SPSS16.0統計軟件進行統計分析，結果用均數±標準差表示。對數據進行正態性、方差齊性檢驗，若同時滿足正態性、方差齊用單因素方差LSD進行組間比較，若方差不齊則用Dunnett T3檢驗，檢驗水準為α=0.05，P≤0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 H2O2誘導及SH-SY5Y細胞活力的變化

表1 濃度梯度H2O2對細胞活力的影響Table 1 Influence of H2O2on growth and viability of SH-SY5Y cells in different concentration

2.2 CSSO對H2O2誘導的SH-SY5Y細胞氧化損傷的影響

由于CSSO是脂溶性化合物，進行細胞藥物干預需要適當的有機溶劑。我們選擇DMSO為溶劑，經細胞毒性試驗，確定其安全濃度范圍為0～2%。通過細胞毒性實驗，設定各配伍比例的用藥濃度范圍。

分別設置濃度梯度的Mix-PUFA(ω-3/ω-6 1∶0.25)、SSO(ω-3/ω-6 0∶1)、CSSO 1(ω-3/ω-6 1∶1.18)、CSSO 2(ω-3/ω-6 1∶6.68)、CSSO 3(ω-3/ω-6 1∶16.1)，預干預細胞24 h，1000 μmol/L H2O2誘導3 h后，MTT結果顯示(表2)，Mix-PUFA在25～100 μg/mL濃度范圍內，與模型組相比細胞活力基本無變化(P＞0.05)，提示其對SH-SY5Y細胞的氧化損傷基本無預防作用;SSO在187.5～375 μg/mL濃度范圍內時，可維持SH-SY5Y細胞活力在79.04～80.27%之間，有統計學意義(P＜0.05)。濃度高于375 μg/ mL時細胞活力開始下降，可能因其對細胞產生一定的毒性所致。

CSSO 1濃度增加保護作用增強，在60～240 μg/mL濃度范圍內與模型組(68.67%)相比，細胞活力先升高后降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，120 μg/mL時細胞活力最大(84.62%)。濃度高于120 μg/mL時，細胞活力開始下降，提示可能出現細胞毒性，預防程度與SSO相比稍有增強，但有效濃度范圍與SSO相比減小。CSSO 2在187.5～1125 μg/mL濃度范圍內可有效保護細胞，與模型組相比(61.17%)有統計學意義(P＜0.01)。在187.5～750 μg/mL的濃度范圍內，濃度增加預防作用增強，750 μg/mL時，細胞活力最大(84.14%)，高于750 μg/mL時細胞活力開始下降，但程度不明顯，提示可能因細胞毒性或實驗誤差所致。CSSO 2預防細胞氧化損傷的作用與SSO及CSSO 1相比增強，與CSSO1相比有效濃度范圍增加，與SSO相比縮小，對細胞的保護程度相對最佳。

CSSO 3在175～2000 μg/mL濃度范圍內隨著濃度增加，預防細胞氧化損傷的作用增強，與模型組(68.16%)相比，有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，2000 μg/mL時，細胞活力最大(85.83%)其有效范圍與SSO相近，但程度有所增強。與SSO、Mix-PUFA及其它CSSO相比預防細胞氧化損傷的有效濃度范圍最寬，但保護的程度與CSSO 2相比較弱。綜合評價CSSO 3預防細胞損傷的效果優于CSSO 1、Mix-PUFA、SSO，但低于CSSO 2。相關性分析結果表明，SSO、Mix-PUFA及CSSO對SH-SY5Y細胞的預防作用均不存在劑量-效應線性相關性。

表3 CSSO預干預后，氧自由基引起的SH-SY5Y細胞活力變化Table 3 The cell viability change of SH-SY5Y after the treatment of CSSO

2.3 流式細胞技術檢測CSSO 2預干預后，對SHSY5Y細胞凋亡率的影響

根據MTT實驗結果，選擇預防氧化損傷綜合效果較好的ω-3/ω-6構成比，即CSSO 2(ω-3/ω-6，1∶6.68)，進一步研究揭示CSSO 2預防氧自由基誘導的細胞凋亡的作用。CSSO 2預干預24 h，H2O2誘導3 h后，用Annexin V-FITC/PI熒光染色劑染色后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率(圖1)。正常生長的細胞幾乎沒有發生細胞凋亡(0.8%)，而模型組細胞凋亡率達25.9%(圖1，B)。經CSSO 2(375和750 μg/mL)預干預后，細胞凋亡率分別下降至12.6%和13.6%，(圖1中C和D)。與MTT實驗所得結論基本吻合，說明CSSO 2在此濃度時，可有效預防氧自由基誘導的細胞凋亡。濃度為1125 μg/mL時細胞凋亡率與模型組相比有所增加，與MTT結果不完全吻合，可能大劑量使用時該濃度體現出細胞毒性。

圖1 CSSO 2干預后，對氧自由基引起SH-SY5Y細胞凋亡率的影響Fig.1 The effects of apoptosis rates cause by oxygen free radical after the treatment of CSSO 2

3 討論

近年來，研究發現阿爾茨海默氏癥、老年癡呆等多種神經退行性疾病(Neurodegenerative Diseases，ND)的發生與活性氧的介入密切相關，活性氧的產生及其對生物大分子的損傷機理研究受到各領域的普遍重視［4］。

CSSO主要生理活性成分為ω-3、ω-6系列多不飽和脂肪酸α-亞麻酸和亞油酸。據已有研究報道，α-亞麻酸和亞油酸在細胞內代謝轉變成DHA、EPA、ARA等二十烷類衍生物，在體內發揮重要的生理作用。α-亞麻酸的代謝產物DHA是視網膜及神經系統細胞膜的主要組成成分，可提高神經細胞的生存能力及傳導能力［5］，增加細胞膜的流動性，作用機理尚未查證。

本研究選擇SH-SY5Y細胞作為神經細胞的模型，以H2O2為刺激源，建立了SH-SY5Y細胞氧化損傷模型，并以二甲基亞砜(DMSO)為脂溶性CSSO的溶劑，對細胞進行預干預。MTT結果顯示，配伍紅花籽油2(CSSO 2)預防細胞氧化損傷作用相對最好，在187.5～1125 μg/mL濃度范圍內有效。流式細胞技術檢測細胞凋亡率提供了更客觀的依據，進一步確定最佳有效預防細胞氧化損傷的濃度范圍為375～750 μg/mL。

由實驗結果可知，混酸(Mix-PUFA)細胞毒性較大，配伍紅花籽油3(CSSO 3)在保證一定的細胞存活率的前提下，有效濃度范圍相對較寬(175～2000 μg/mL)。提示，配伍紅花籽油(CSSO)中ω-3的相對量，對預防細胞氧化損傷起決定性作用，其濃度相對較低時，可提高CSSO的有效濃度范圍，但保護程度降低，當其含量達到某一值時(ω-3/ω-6 1∶6.68)雖然有效濃度范圍縮小，但對細胞氧化損傷的保護效果提高約10%，由此推測CSSO對氧化損傷引起的ND可能有潛在的預防作用，且這種作用可能與ω-3和ω-6的比例直接相關。由MTT實驗可知，CSSO對細胞氧化損傷的預防效果明顯優于配伍原料SSO和Mix-PUFA，充分體現了配伍使用的優越性。

目前，治療ND的藥物以膽堿酯酶抑制為主，該類型的藥物存在半衰期短、較嚴重的外周膽堿能系統副作用、肝毒性等缺點，臨床應用前景受到限制［6，7］。因此，對ND治療藥物的研究，逐漸轉向天然抗氧化活性物質的開發。通過本研究，我們可認為一定ω-3、ω-6構成比的配伍紅花籽油具有預防氧自由基誘導的細胞損傷(凋亡)的效應，有作為天然預防ND的抗氧化活性物質開發的潛力，為新疆紅花藥用資源的開發與利用提供理論依據。

1Wu GR(吳桂榮)，Mao XM(毛新民)，Wang Y(王巖).Effect of safflower oil emulsion on lipid lowing.Chin J New Drug，2003，12(2):111.

2 Zhang YR(張艷榮)，Zhang YY(張雅媛)，Li Y(李玉).Anti-thrombosis action of Agaricus blazei Murrill ω-6 polyunsaturated fatty acid on rats and mice.J Jilin Univ(Med Ed)，2006，32:774-776.

3 Xu ZH(徐章華)，Shao YF(邵玉芬).Effects of α-linolenic acid on rats`behavior，retina and liver，brain fatty acid composition.China Public health，2002，18:301-303.

4 Mandem akers W，Morais VA，De Strooper B.A cell biological perspective on mitochondrial dysfunction in Parkinson disease and other neurodegenerative disease.J Cell Sci，2007，(10):1707-1716.

5 Chalon S，Vancassel S，Zimmer L，et al.Polyunsaturated fatty acids and cerebral function:focus on monoaminergic neurotransmission.Lipids，2001，36:937-944.

6 Rogers SL，Farlow MR，Doody RS，et al.A-4-week，doubleblind，placebo-control ledtrial of donepezilin patients with Alzheimer’s disease.Neurology，1998，50:136.

7 Lim GP，Chu T，Yang F，et al.The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse.J Neurosci，2001，21:8370-8377.

Preventive Effect of Different ω-3/ω-6 Constituent Ratio of Compatibility Safflower Seed Oil on SH-SY5Y Cells against Oxidative Cell Damage

WU Di1，WU Gui-rong1，Abulizi ABUDULA2，SHENG Lei2，Bahaerguli KAHAER1*1Department of Pharmacochemistry and Organic Chemistry，College of Pharmacy，Medical University of Xinjiang;2Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology and Endemic Diseases，College of Preclinical Medicine，Medical University of Xinjiang，Urumqi 830011，China

In order to investigate the preventive effect of different ω-3/ω-6 constituent ratio of compatibility safflower seed oil(CSSO)on SH-SY5Y human neuroblastoma cells against oxidative cell damage，an oxidative cell damage model was established by using hydrogen peroxide(H2O2)as a donor of free reactive oxygen species，and after treatment of cells with different ω-3/ω-6 constituent ratios of CSSO，the alteration of cell viability and cellular apoptosis were determined by MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)assay and flow cytometry.We successfully established the oxidative cell damage model of SH-SY5Y cells induced by H2O2，with the IC50value of 1089.54 μmol/L H2O2.The preventive effect of CSSO against oxidative cell damage increased along with the decreasing amount of ω-3 content in CSSO.Moreover，at the ω-3/ω-6 ratio of 1:6.68 and effective dose range of 375-750 μg/mL CSSO，the cell viability was increased significantly to a higher level in the treatment group(84.1%)than in the control(61.1%)，and cellular apoptosis was decreased markedly to a lower level(12.6%)in treatment group than in the control(25.9%).The results suggested that CSSO was able to protect the cells and prevent from oxidative cell damage caused by reactive oxygen species，and this effect may be closely associated with the ω-3/ω-6 constituent ratio in CSSO.

compatibility safflower seed oil;oxidative damage;SH-SY5Y;MTT

1001-6880(2011)03-0420-05

2010-06-22 接受日期:2010-12-06

新疆維吾爾自治區重點實驗室基金項目(XJDX0208-2006-07)

*通訊作者 Tel:86-991-4362470;E-mail:bahaerguli_k@126.com

Q946.91;R285

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