“齊二藥”亮菌甲素注射液毒性物質篩查研究Δ

李瑾翡，梁 祈，黎（廣東省藥品檢驗所，廣州市 510180）

中圖分類號R927.1；R975+.5文獻標識碼A文章編號1001-040（82011）05-0437-03

“齊二藥”亮菌甲素注射液毒性物質篩查研究Δ

李瑾翡＊，梁 祈，黎（廣東省藥品檢驗所，廣州市 510180）

中圖分類號R927.1；R975+.5文獻標識碼A文章編號1001-040（82011）05-0437-03

目的：對“齊二藥”事件中亮菌甲素注射液進行毒性物質篩查研究，尋找發生原因及建立相關的應急檢驗方法。方法：對“齊二藥”與大理藥業有限公司生產的亮菌甲素注射液進行小鼠急性毒性試驗（半數致死量LD50）比較；對亮菌甲素注射液中輔料聚乙二醇400進行小鼠急性毒性實驗，篩查正常的輔料是否含有毒性物質；用氣相色譜法測定2個廠家產品中二甘醇的含量，并用氣-質聯用色譜法對“齊二藥”亮菌甲素注射液中二甘醇進行成分確證。結果：2個廠家的亮菌甲素注射液LD50分別為17.72、21.06mL·kg－1，二甘醇含量分別為293mg·mL－1、未檢出；聚乙二醇400小鼠組均存活，并表現正常；氣-質聯用色譜法證實“齊二藥”亮菌甲素注射液中含有二甘醇。結論：確認“齊二藥”亮菌甲素注射液毒性增大是由二甘醇引起的；利用動物實驗對毒性物質進行篩查可用于藥品質量的應急檢驗。

“齊二藥”事件；亮菌甲素注射液；毒性物質；二甘醇；應急檢驗

亮菌甲素注射液在臨床上主要用于急、慢性肝炎及膽道疾病的治療，其處方組成為亮菌甲素、丙二醇、聚乙二醇400、聚山梨酯-80。2006年5月2日，廣東省不良反應監測中心接廣州市不良反應監測中心報告，中山大學第三附屬醫院出現8例疑似急性腎功能衰竭患者，這些患者均使用了齊齊哈爾第二制藥廠（以下簡稱齊二藥）生產的亮菌甲素注射液，這就是震驚全國的“齊二藥”假藥事件。為快速查明發生不良反應原因，筆者當時首先對“齊二藥”和大理藥業有限公司（以下簡稱大理藥業）生產的亮菌甲素注射液和相關輔料進行了毒性篩查實驗，并根據毒性篩查結果以及按現行質量標準對產品進行檢驗，結果發現產品符合標準規定。另又溯源追蹤，根據其輔料之一聚乙二醇400在質量控制中需要對二甘醇和乙二醇含量進行控制的要求，以及二甘醇在歷史上多次發生藥害事件這些線索，通過氣相色譜法對產品進行對比分析，結果發現“齊二藥”的亮菌甲素注射液中含有30%的二甘醇，而大理藥業產品中未含有二甘醇，從而找出了事件發生的原因，為該事件的及時、有效處理提供了有力的技術支撐。筆者在此進行總結研究，以為建立相關的應急檢驗方法提供參考。

1 儀器與材料

1.1 試藥

亮菌甲素注射液（齊二藥，批號：06030501，規格：5mg·10mL－1；大理藥業，批號：051202，規格5mg·10mL－1）；二甘醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20050928）；丙二醇（批號：940506，分析純）、聚山梨酯-80（批號：981201-3）、丙三醇（批號：20040803-1，分析純）均由廣州化學試劑廠提供；聚乙二醇400（遼陽華興藥用輔料廠，批號：20060223006）。

1.2 動物

NIH小鼠，SPF級，♀♂各半，18～28g，購于廣東省醫學實驗動物中心，動物合格證號：2005A011，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2004-0050。

1.3 儀器

Agilent 6890N型氣相色譜儀（美國安捷倫公司）；HP6890GC/5973MS型氣相色譜-質譜聯用儀（美國惠普公司）。

2 方法與結果

2.1 亮菌甲素注射液毒性篩查實驗

取NIH小鼠18只，♀♂各半，分為3組，每組6只小鼠，其中一組為齊二藥生產的亮菌甲素注射液組（簡稱齊二藥組），另一組為大理藥業生產的亮菌甲素注射液組（簡稱大理組），同時設0.9%氯化鈉注射液組為陰性對照組。各給藥組小鼠分別尾靜脈注射供試品原液每只0.5mL（相當于人臨床用量的111倍，人臨床用藥按每60kg注射10mL計），注射速度為15s。觀察一次性給藥后小鼠外觀、行為及死亡情況，觀察期為7d，并對死亡小鼠進行大體解剖，取肝、腎組織，以10%福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色，于OlympusBX41顯微鏡下進行觀察。

結果，齊二藥組給藥后3～5min內，6只小鼠均死亡，解剖死亡小鼠可見腎臟顏色較正常小鼠深，肝臟呈粒狀、針狀結節，病理組織學檢查可見小鼠肝細胞呈輕度脂肪變性，腎小管上皮細胞壞死明顯；大理組6只小鼠均未出現死亡現象，小鼠解剖及肝、腎病理檢查未發現異常。提示同等劑量下，齊二藥產品毒性大于大理產品，且齊二藥產品毒性靶器官為肝、腎。小鼠腎臟、肝臟外觀分別見圖1、圖2，其病理切片分別見圖3、圖4。

圖1 2組小鼠腎臟外觀比較Fig 1 Comparison of the kidney appearance of mice

圖2 2組小鼠肝臟外觀比較Fig 2 Comparison of the liver appearance of mice

圖3 各組小鼠腎臟病理切片圖（HE×100）Fig 3Pathological section map of mice kidney（HE×100）

圖4 各組小鼠肝臟病理切片圖（HE×100）Fig 4Pathological section map of mice liver（HE×100）

2.2 亮菌甲素注射液半數致死量（LD50）測定[1]

取小鼠，按體重、性別隨機分成11組，每組10只，♀♂各半；各劑量間距根據受試物情況和預試結果，設定為0.8∶1，齊二藥組劑量分別為25.0、20.0、16.0、12.8、10.24mL·kg－1，大理組劑量分別為31.5、25.0、20.0、16.0、12.8mL·kg－1，樣品稀釋溶劑為0.9%氯化鈉注射液，各組小鼠分別靜脈注射各濃度的受試溶液，給藥體積為0.5mL·20g－1，注射速度為30s；同時設氯化鈉注射液對照組（陰性對照），給藥劑量為0.5mL·20g－1，觀察一次性給藥后小鼠外觀、行為及死亡情況，觀察期為14d，用Bliss統計學方法計算出LD50值。

結果，靜脈注射給予齊二藥亮菌甲素注射液，劑量為20.0、25.0mL·kg－1組部分小鼠出現抽搐、死亡或蜷伏，最快死亡時間在3min內，小鼠死亡多發生在注射當天和第2天；大理組在給藥31.5mL·kg－1后部分小鼠出現抽搐、死亡或蜷伏，最快死亡時間在10min內，死亡多發生在注射后第2天。2組存活小鼠觀察前期活動減少、食欲降低、體重減輕，觀察后期逐步恢復正常；氯化鈉注射液對照組小鼠未見異常及死亡。

采用新藥統計軟件（NDST，5.1版本），用Bliss法計算LD50及95%的可信限。在等給藥體積、不等給藥濃度情況下，齊二藥組LD50為17.72mL·kg－1，其95%的可信限是15.06～20.92mL·kg－1；而大理組的LD50為21.06mL·kg－1，其95%的可信限是19.0～23.46mL·kg－1，結果詳見表1。

表1 2個廠家亮菌甲素注射液小鼠急性毒性實驗結果Tab 1 Results of acute toxicity test of Armillarisin A injection produced by 2companies

2.3 亮菌甲素注射液輔料毒性篩查實驗

亮菌甲素注射液的處方中含聚乙二醇40015g，聚乙二醇400質量標準[2]顯示其含有雜質二甘醇，毒性可能較大。筆者在實驗中設定了缺主藥亮菌甲素外的其他配方成分組和聚乙二醇400高、低劑量組共3個實驗組。取小鼠，按體重隨機分為3組，每組5只，第1組按照亮菌甲素注射液處方量[3]，在實驗室制備出缺主藥亮菌甲素外的溶液（配方為丙二醇（15g）、聚乙二醇400（10g）、聚山梨酯-80（1g）、水（少量），水浴加熱煮沸10min，加入已溶解的硫脲，加水至50mL，用枸櫞酸調pH 4.2～5.2，即得）；第2組為聚乙二醇400組（原液組）；第3組為聚乙二醇400稀釋液組（1∶5）（取聚乙二醇400用注射用水進行稀釋）。每只小鼠分別尾靜脈注射上述受試溶液0.8mL，觀察一次性給藥后小鼠外觀、行為及死亡情況，觀察期為7d。

結果，3組小鼠均存活，表現正常，未發現輔料有直接毒性反應，基本排除了正常輔料本身可能產生的異常毒性作用。

2.4 毒性物質篩查試驗

在完成用小鼠進行毒性篩查實驗基礎上，根據其輔料之一聚乙二醇400在質量控制中需要對二甘醇和乙二醇含量進行控制的要求，以及二甘醇在歷史上多次發生藥害事件這些線索，用氣相色譜法測定亮菌甲素注射液中二甘醇含量及采用氣-質聯用色譜定性檢測二甘醇。

2.4.1 采用氣相色譜法[4]定量測定二甘醇含量。以丙三醇為內標，制備對照品溶液。精密稱取二甘醇對照品0.05381g，加內標溶液（取丙三醇適量，精密稱定，1.0049g，加水溶解并稀釋至2000mL，搖勻，即得）溶解，并用內標稀釋成每1mL中含53.81、107.62、215.24、322.86、430.48、538.10μg二甘醇的系列標準溶液和供試品溶液（精密量取批號為06030501樣品2.0mL，置于20mL容量瓶中，加內標溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；再取2.0mL置于200mL容量瓶中，加內標溶液溶解稀釋至刻度，搖勻，即得）。同時取大理藥業生產亮菌甲素注射液（批號為051202）同法處理進行測定。

精密量取對照品溶液和供試品溶液各0.2μL注入氣相色譜儀。色譜條件：聚乙二醇彈性石英毛細管柱（柱長15m，內徑0.53mm，膜厚1.0μm），程序升溫：初始溫度為140℃，保持1min；以每分鐘8℃的速度升至220℃，保持5min。進樣口溫度為220℃，檢測器溫度為250℃，不分流進樣，載氣為氮氣，壓力為2.2psi。記錄色譜圖，測定供試品中二甘醇的含量[5]。色譜見圖5。

圖5 亮菌甲素注射液氣相色譜圖A.二甘醇對照品；B.齊二藥亮菌甲素注射液；C.大理藥業亮菌甲素注射液Fig 5 GC chromatogram ofArmillarisinAinjection A.diethylene-glycol control；B.Armillarisin A injection produced by Qiqihar Second Pharmaceutical Company；C.Armillarisin A injection produced by Dali Pharmaceutical Limited Company

由圖5可見，保留時間約為6.3min者為二甘醇峰，約為10.2min者為丙三醇峰。結果顯示，齊二藥亮菌甲素注射液中含有二甘醇，含量為292.8mg·mL－1；大理藥業亮菌甲素注射液中不含二甘醇。

2.4.2 采用氣-質聯用色譜定性檢測二甘醇。制備對照品溶液（精密稱取二甘醇對照品20.4mg，加甲醇適量使溶解，并再加甲醇稀釋至50mL）和供試品溶液（精密量取齊二藥亮菌甲素注射液5mL，加甲醇稀釋至濃度為原液1%的溶液）。分別精密量取2種溶液各1.0μL注入氣相色譜-質譜聯用儀。氣相色譜條件：毛細管色譜柱 OV-1（15m×0.2mm×0.25μm），柱溫：初始溫度為80℃，以每分鐘10℃的速度升至260℃；進樣口溫度：250℃，柱前壓：55KPa，連接線溫度：280℃，分流比：1/30。質譜條件：EI離子源，離子源溫度：230℃，掃描范圍：29～400amu，電子倍增器：1400V。

通過對亮菌甲素注射液中“二甘醇”進行確證，結果證實齊二藥亮菌甲素注射液多出的峰為二甘醇的峰。

3 討論

齊二藥亮菌甲素注射液的LD50是17.72mL·kg－1，大理產品的LD50是21.06mL·kg－1，2個廠家的產品毒性相差3.34mL·kg－1；病理檢查結果顯示，齊二藥的亮菌甲素注射液致死小鼠的肝細胞呈輕度脂肪變性，腎小管上皮細胞壞死明顯，而大理藥業組小鼠未發現肝、腎有異常現象，提示齊二藥亮菌甲素注射液毒性大于大理藥業的亮菌甲素注射液。

氣相色譜測定結果表明，齊二藥亮菌甲素注射液每1mL中含292.8mg二甘醇，基于2個樣品中除了齊二藥亮菌甲素注射液含有二甘醇外，其他基本相同的結果，可以認為齊二藥亮菌甲素注射液毒性增大是其中所含二甘醇引起的。

本研究通過小鼠急性毒性實驗，快速比較出齊二藥產品的毒性比大理藥業產品毒性大，這樣在應急檢驗中使研究者將目光集中在藥品質量上來，排除了對其他可能引起藥害的原因的懷疑，可見利用動物實驗進行毒性篩查在藥品質量應急檢驗中有著非常重要的作用，其可以在較短時間內提供毒性程度、靶器官，以及整體毒性情況，可為下一步的藥品質量分析指明方向，是應急檢驗中的重要組成部分。

分析中，筆者根據事件發生醫院此前長期使用大理藥業同品種產品未出現類似問題，而此次是該院第1次使用齊二藥產品的事實，從而產生了尋找參照物進行對比實驗研究的思路。故在研究中對不同廠家生產的亮菌甲素注射液進行對比實驗，并在短時間內比較出同品種不同廠家樣品的差異，因此，同品種比對分析是該次應急檢驗取得成功的關鍵因素之一。

藥品質量應急檢驗在我國是一個全新的課題，急需建立相應質量排查方法。此文報道的對齊二藥亮菌甲素注射液毒性物質進行篩查的研究，是藥品質量應急排查的一個成功案例，其經驗值得推廣應用。

[1] 國家食品藥品監督管理局.化學藥物急性毒性試驗技術指導原則[S].2005.

[2] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：916、附錄30、31.

[3] 國家藥品監督管理局.亮菌甲素注射液國家藥品標準[S].2002.

[4] 國家食品藥品監督管理局.國家食品藥品監督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件[S].2006.

Screening of Toxic Substance from Armillarisin A Injection in“Qieryao”Adverse Drug Events

LI Jin-fei，LIANG Qi，LI Yang（Guangdong Institute for Drug Control，Guangzhou 510180，China）

OBJECTIVE：To detect the toxic substance from Armillarisin A injection in“Qieryao”adverse drug events，and to find out the cause and establish emergency laboratory method.METHODS：Mice acute toxicity test was conducted to compare the toxicity （LD50）between Armillarisin A injection produced by Qiqihar Second Pharmaceutical Company and Dali Pharmaceutical Limited Company.The toxicity of PEG400in Armillarisin A injection was determined to confirm whether general excipients contained toxic substance.The contents of diethylene-glycol in Armillarisin A injection from 2companies were determined by GC；the diethylene-glycol component of Armillarisin A injection produced by Qiqihar Second Pharmaceutical Company was confirmed by GC-MS spectrometry.RESULTS：The LD50of Armillarisin A injection from 2companies were 17.72mL·kg－1and 21.06mL·kg－1；the content of diethylene-glycol was 293mg·mL－1in Armillarisin A injection produced by Qiqihar Second Pharmaceutical Company while hadn’t been detected in the other one.Mice used PEG400survived and grew normally.GC-MS spectrometry confirmed that Armillarisin A injection produced by Qiqihar Second Pharmaceutical Company contained diethylene-glycol.CONCLUSION：It has been confirmed that the increasing toxicity of Armillarisin A injection produced by Qiqihar second pharmaceutical company is induced by diethylene-glycol.The screening of toxic substance by animal experiment can be used for emergency laboratory method.

“Qieryao”events；Armillarisin A injection；Toxic substance；Diethylene-glycol；Emergency laboratory method

Δ廣東省科技廳2008年資助項目（2008A060202003）

＊主任藥師，碩士。研究方向：藥品檢驗、藥品安全性評價。電話：020-81886208。E-mail：jinfeii@hotmail.com

2010-04-20

2010-08-16）