霍爾多巴吉鵝源小鵝瘟病毒VP3基因的克隆及序列分析

董 浩，段小波，單曉楓，胡桂學(xué)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春130118）

小鵝瘟即鵝細(xì)小病毒病（goose parvovirus，GPV），是雛鵝和雛番鴨的一種急性或亞急性敗血性傳染病，主要侵害3～20日齡雛鵝和雛番鴨，以出血性、纖維素性滲出性腸炎為主要特征。該病傳染快，發(fā)病率和死亡率高，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)的重要傳染病之一。現(xiàn)已證明，GPV基因組為單鏈、線性DNA，大小約為5.0kb，完整的病毒粒子呈六面體，無囊膜，含正鏈DNA和負(fù)鏈DNA的病毒粒子數(shù)目基本相等，兩種極性鏈很容易發(fā)生退火。其基因組含有兩個(gè)主要開放性閱讀框（ORF），右側(cè)ORF（RORF）編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（VP），即 VP1、VP2、VP3，它們位于同一讀碼框，共用一個(gè)終止密碼子；左側(cè)ORF（LORF）編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（NS）。其中，VP3為主要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒衣殼的主要成分，約占總蛋白量的80%，且暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激集體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的抗原蛋白［1］。

霍爾多巴吉白鵝具有個(gè)體大、體質(zhì)健壯、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，產(chǎn)絨率高、羽絨品質(zhì)好，與當(dāng)?shù)仄胀ò座Z相比具有明顯的優(yōu)勢。近幾年，吉林省多個(gè)地區(qū)的鵝業(yè)公司從匈牙利引進(jìn)霍爾多巴吉白鵝種蛋進(jìn)行孵化，擴(kuò)充商品鵝資源。本試驗(yàn)采用的小鵝瘟GPV－H株是從吉林省某鵝廠病死的霍爾多巴吉雛鵝體內(nèi)分離得到的［2］，本試驗(yàn)主要通過對VP3基因的克隆和序列分析，了解本次發(fā)病的霍爾多巴吉雛鵝體內(nèi)的小鵝瘟病毒的來源，為了解小鵝瘟的傳播途徑和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株、毒株 大腸桿菌DH5α購于TaKa－Ra［寶生物工程（大連）有限公司］；小鵝瘟病毒GPV－H是從吉林地區(qū)某鵝廠病死的霍爾多巴吉雛鵝體內(nèi)分離到。

1.2 引物 根據(jù)鵝細(xì)小病毒基因序列（GenBank登錄號為GPU25749）設(shè)計(jì)并合成了1對引物P1/P2，擴(kuò)增全長GPV VP3基因片段1.6kb，由大連TaKaRa公司合成。斜體部分為酶切位點(diǎn)。

1.3 主要試劑 瓊脂糖購于格特蘭試劑公司；TaKaRa質(zhì)粒小提試劑盒、TaKaRa膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ，T4連接酶；ExTaq酶，dNTP混合液，ExTag Buffer等購于TaKaRa［寶生物工程（大連）有限公司］。

1.4 小鵝瘟病毒核酸的提取 取GPV－H毒株鵝胚尿囊液500μL，經(jīng)90℃水浴處理10min后，加入蛋白酶K（50μg/mL）和終濃度為1%SDS，56℃水浴40min，用等體積的酚/氯仿，氯仿依次抽提后，用乙醇沉淀核酸，70%乙醇漂洗，靜置風(fēng)干后用TE緩沖液懸浮，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 VP3基因的擴(kuò)增 以1.4提取的核酸為模板，以P1、P2為引物，擴(kuò)增GPV－H目的基因。PCR反應(yīng)體系如下：10×ExTaqBuffer，2.5μL；P1（20 pmol/μL），0.5μL；P2 （20pmol/μL），0.5μL；dNTP，2μL；模板DNA，2.5μL；四餾水，16.5μL；ExTaqTMDNA聚合酶，0.5μL。

PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min、54℃退火1min、72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃徹底延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 VP3的PCR產(chǎn)物的克隆 按照TaKaRa公司膠回收試劑盒說明書進(jìn)行操作，回收純化1.5產(chǎn)物目的片段，回收產(chǎn)物與pMD 18－T－simple載體相連接。連接體系為：Ligation solution I 5μL，pMD 18－T－simple 1μL，回收產(chǎn)物2μL，去離子水2μL，共10μL，混勻，16℃2h。

1.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 取1.6中連接產(chǎn)物5μL轉(zhuǎn)入200μL大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴放置30min，42℃熱激90s，再置冰浴中2min，加入100μL LB液體培養(yǎng)基，37℃，200r/min振搖1h后，按常規(guī)方法涂布于含有Amp（25μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上。37℃培養(yǎng)12～16h。

1.8 重組子的篩選與鑒定 挑取1.7平板上白色菌落若干個(gè)，接種至5mL含25μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)過夜。按照質(zhì)粒提取試劑盒操作步驟，對得到的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。用BamHⅠ單酶切以及BamHⅠ和HindⅢ雙酶切進(jìn)行鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。

1.9 重組質(zhì)粒的測序與分析 將質(zhì)粒酶切鑒定為陽性的菌液送往寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行序列測定，采用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析。參考序列見表1。

表1 參考毒株

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 根據(jù)VP3基因組序列設(shè)計(jì)的特異性引物，以小鵝瘟基因組DNA作模板，擴(kuò)增出長度約為1 600bp的條帶（圖1）。

圖1 VP3基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒的篩選和酶切鑒定結(jié)果 用BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，通過電泳，在1 600bp和2 700bp處得到兩條特異性條帶，見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果1～3：轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒；4：λ－HindⅢdigest DNA Marker

2.3 GPV－H VP3基因序列分析結(jié)果 GPV－H株VP3基因測序結(jié)果顯示：基因全長為1 605bp，編碼534個(gè)氨基酸。與參考毒株的基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核苷酸同源性在92.5%～98.9%之間。通過DNAMAN軟件作出基因進(jìn)化樹，分析表明，GPV－H株與波蘭和匈牙利分離到的5株病毒親緣關(guān)系較近（圖3）。

圖3 14株小鵝瘟病毒VP3基因進(jìn)化樹分析

3 討論

本試驗(yàn)克隆了鵝細(xì)小病毒GPV－H株的VP3基因，其序列與GenBank中發(fā)表的13株鵝細(xì)小病毒具有高度的同源性，達(dá)到了92.5%～98.9%，表明鵝細(xì)小病毒的VP3基因是高度保守的。這也表明用一種疫苗，可以防治大部分國內(nèi)外野毒株的感染［3］。

本次試驗(yàn)的發(fā)病鵝源為霍爾多巴吉白鵝，此種鵝原產(chǎn)地為匈牙利，近幾年，在吉林省常以種蛋形式被引進(jìn)孵育，從基因進(jìn)化樹結(jié)果表明，本試驗(yàn)所分離到的GPV－H株與匈牙利、波蘭等歐洲地區(qū)報(bào)道的小鵝瘟基因序列親緣關(guān)系最近，極有可能是以種蛋帶毒方式，被引進(jìn)到本省。

［1］ 賀云霞，王君偉，王立群，等.鵝細(xì)小病毒H1株VP2基因的克隆和序列分析［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25（5）：330－333.

［2］ 董浩，馬磊，單曉楓，等.霍爾多巴吉白鵝小鵝瘟病毒的分離與鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，2010，46（10）：49－50.

［3］ Karsten Hueffer.The natural host range shift and subsequent evolution of canine parvovirus resulted from virus－specific binding to the canine transfer in receptor［J］.Journal of Virology，2003，2：1718－1726.